基于网络药理学联合分子对接技术探讨肾疏宁防治肾间质纤维化的作用机制*

于雯雯，秦苏杨，王耀光

（天津中医药大学第一附属医院，国家中医针灸临床医学研究中心，天津 300381）

慢性肾脏病（CKD）现今已成为一种严重危害人类生命健康的慢性疾病。肾间质纤维化（RIF）是各种CKD发展至终末期肾病的共同通路，是CKD的主要病理表现[1]。近年来，随着肥胖、糖尿病、高血压的增多[2]，CKD的发病率也普遍上升[3]，RIF人数也随之增长。多项研究发现，延缓RIF进展可有效保护尚未损坏的肾功能，对CKD的治疗有重要意义。

中医药在治疗肾脏病中积累了丰富经验。肾疏宁是黄文政教授以“疏利少阳三焦”为主要治则，经天津中医药大学第一附属医院肾病科多年临床实践研究，筛选组合而创的中药复方[4]，由柴胡，黄芪，黄芩，丹参，鬼箭羽，山茱萸，萹蓄，白花蛇舌草，益母草组成。现代药理研究[5-6]发现，肾疏宁能改善肾小球系膜功能和肾小管的通透性，优化蛋白质的代谢[7]。王耀光教授临床实践[8]证明肾疏宁方能明显改善患者的临床症状、部分肝肾功能指标，并能减少尿蛋白，对CKD有一定疗效。

网络药理学通过网络和软件分析来预测中药的作用机制，为中医药研究提供了一种新的思维方式，使中药多成分、多靶点的治疗特点在临床治疗中能充分发挥其优势[9]。本文基于网络药理学，结合分子对接技术，以分析肾间质纤维化高度相关的信号通路为主，探讨肾疏宁防治肾间质纤维化的机制，以期为临床运用提供参考。

1 材料与方法

1.1 肾疏宁相关靶点筛选 借助中药系统药理学分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）检索肾疏宁中（柴胡，黄芪，黄芩，丹参，鬼箭羽，山茱萸，萹蓄，白花蛇舌草，益母草）9味中药的化学成分[10]，TCMSP数据库设定口服利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18，初步筛选出活性成分及作用靶点，并根据相关文献进行补充。借助Uniprot蛋白质数据库（https：//www.uniprot.org）将化合物的蛋白质靶点与其基因名进行对应匹配；建立肾疏宁化学成分-靶点数据库。

1.2 肾疏宁防治肾间质纤维化相关靶点筛选 通过检索 GeneCards 数据库（https：//www．genecards．org）、药物靶标数据库（TTD，http：//bidd．nus．edu．sg/group/cjttd）、在线《人类孟德尔遗传》数据库（OMIM，https：//www．omim．org），以“Renal Interstitial Fibrosis”为关键词，检索出防治疾病的潜在靶点。合并所有疾病数据库靶点删除重复值得到最终疾病相关靶点，将两者靶点进行映射并绘制韦恩图。

1.3 肾疏宁成分-肾间质纤维化靶点网络图的构建 运用CytoScape3．8．0构建肾疏宁成分-肾间质纤维化靶点网络图，并分析有效成分及靶点的网络拓扑参数，包括连接度（Degree）、介度（Betweenness Centrality）及紧密度（Closenesss Centrality）等，最后根据网络拓扑学参数判断核心靶点及发挥药效的主要活性成分。

1.4 肾疏宁成分-肾间质纤维化靶点PPI网络构建 为了找出药物与疾病靶点间的相互作用关系，将两者交集靶点进行互作分析，利用Cytoscape3．8．0软件构建PPI网络并进行可视化呈现。

1.5 肾疏宁成分-肾间质纤维化功能与通路的富集分析 将肾疏宁防治RIF的靶点录入DAVID Bioinformatics Resources 6．8 平台，设定 P＜0．05，进行基因本体论（GO）生物学过程富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析，根据P值FDR值大小排序，并选取排名高的信号通路通过在线绘图网站bioinformatics（http：//www．bioinformatics．com．cn）将其结果进行可视化呈现；并构建肾疏宁防治肾间质纤维化的靶点-通路网络图。

1.6 肾疏宁成分-肾间质纤维化靶点的分子对接 将肾疏宁成分-肾间质纤维化靶点网络图中度值，介度，紧密度高的活性成分通过ZINC（http：//zinc．docking．org）网站查找其3D结构。将PPI网络中度值排名靠前的靶点从PDB数据库（https：//www．rcsb．org/）中找出其 3D 结构，通过 AutoDock Tools 1．5．6逐一对接，只保留Affinity（kcal/mol）绝对值最高的对接结果，并用R语言绘制热图。再利用Pymol软件进行可视化呈现。

2 结果

2.1 肾疏宁活性成分靶点获取 初步提取肾疏宁的中药成分，筛选得到有效成分柴胡17种，黄芪20种，黄芩36种，丹参65种，鬼箭羽8种，山茱萸20种，萹蓄2种，白花蛇舌草7种，益母草8种。得出每味药物成分的作用靶点，柴胡88个，黄芪98个，黄芩62个，丹参74个，鬼箭羽82个，山茱萸42个，萹蓄69个，白花蛇舌草88个，益母草100个，合并删除重复值后得到靶点232个。根据OB和DL高低筛选出主要活性成分为山柰酚、槲皮素、异鼠李素、豆甾醇等（见表1）。

表1 肾疏宁主要活性成分的基本信息Tab.1 Basic information of main active components of Shenshuning

2.2 肾间质纤维化相关靶点获取 从Genecards数据库找出疾病靶点 2 783个，设定 Score＞5．3（中位数）。并结合OMIM、TTD数据库补充相关靶点，合并删除重复值后得到1 371个相关靶点。将筛选的药物靶点与疾病靶点取交集，并绘制韦恩图，得到中药药物成分-疾病共同靶点116个（见图1）。

图1 肾疏宁成分-肾间质纤维化靶点韦恩图Fig.1 Wayne diagram of the components of Shenshuning-RIF target

2.3 肾疏宁成分-肾间质纤维化靶点网络图构建 运用CytoScape3．8．0构建肾疏宁成分-肾间质纤维化靶点网络图（见图2）。中药与疾病相关的活性成分130个，包含中药共有成分10个（见表2），药物独有成分丹参56个、黄芩28个、柴胡8个、山茱萸8个、黄芪14个、白花蛇舌草1个、益母草4个、鬼箭羽1个、扁蓄0个。并分析有效成分及靶点的网络拓扑参数，其中排名前8的成分依次为槲皮素、矮牵牛素、异鼠李素、花生四烯酸、山奈酚、丹参酮、联苯酸脂、豆甾醇（见表3）。

图2 肾疏宁成分-肾间质纤维化靶点网络图表Fig.2 Target network of the components of Shenshuning-RIF target

表2 肾疏宁不同药物的相同活性成分Tab.2 The same active components of different drugs of Shenshuning

肾间质纤维化的主要病理过程包括：上皮-间质细胞转分化（EMT）、细胞外基质（ECM）沉积、氧化应激、细胞凋亡、血管紧张素系统活性升高及各种细胞因子间的相互作用等[14]。本研究基于网络药

2.4 PPI网络构建 将肾疏宁成分-肾间质纤维化靶点提交至STRING11.0平台，利用Cytoscape3.8.0软件构建PPI网络（见图3），并根据其degree值将其可视化（见图4）。肾疏宁治疗RIF的主要潜在靶点为肿瘤坏死因子（TNF），蛋白激酶B1（AKT1），JUN，丝裂原活化蛋白激酶 1（MAPK1），RELA，TP53。

图3 肾疏宁成分-肾间质纤维化靶点PPI网络Fig.3 PPI network of the components of Shenshuning-RIF target

图4 肾疏宁治疗肾间质纤维化主要靶点可视化Fig.4 Visualized bar chart of degree value of targets of Shenshuning in the treatment of RIF

2.5 富集分析 应用DAVID 6.8数据平台对肾疏宁防治肾间质纤维化相关靶点进行分析，通过在线绘图网站bioinformatics以及R语言将其结果进行可视化呈现（见图5）。GO富集结果表明肾疏宁治疗疾病可能通过炎症反应、细胞凋亡、氧化应激反应等过程调节发挥作用。KEGG分析结果显示这些靶点主要富集映射在 TNF、NF-κB、AGE-RAGE 等高度相关的信号通路（见图6、表4）。并以前25条通路构建肾疏宁防治肾间质纤维化的靶点-通路网络图（见图7）。

图5 肾疏宁防治肾间质纤维化靶点GO分析Fig.5 GO analysis of the target point of Shenshuning in the prevention and treatment of RIF

图6 肾疏宁防治肾间质纤维化靶点KEGG分析Fig.6 KEGG analysis of the target point of Shenshuning in the prevention and treatment of RIF

图7 肾疏宁防治肾间质纤维化的靶点-通路网络图Fig.7 Target-pathway network of Shenshuning in the prevention and treatment of RIF

表4 肾疏宁防治肾间质纤维化靶点通路富集结果Tab.4 Enrichment results of target pathway of Shenshuning in the prevention and treatment of RIF

2.6 分子对接 结果显示有效活性成分豆甾醇、丹参酮、异鼠李素与核心靶点之间有较好的结合活性；核心靶点TNF、RELA与有效成分的结合活性较好（见图8）。同时借助Pymol2.5.0软件分别对山奈酚与TNF，异鼠李素与TNF，豆甾醇与TNF，丹参酮与TNF，异鼠李素与RELA，豆甾醇与RELA进行分子对接可视化（见图9）。

图8 肾疏宁中的关键活性化合物与PPI核心靶蛋白分子对接热图Fig.8 Heat map of the docking between key active compounds and PPI core target protein in Shenshuning

图9 肾疏宁中关键活性化合物与PPI核心靶蛋白分子对接Fig.9 Docking of key active compounds and PPI core target protein in Shenshuning

3 讨论

肾间质纤维化是CKD的病理标志和主要表现[1]。依据其临床症状及发病特点，中医可归属于“水肿”“癃闭”“关格”“虚劳”“肾风”等病证范畴[11-12]。黄文政教授认为湿热内蕴是本病的主要病机，肾疏宁是在以“少阳主枢”“三焦气化”为理论指导创立的，以疏利少阳为主要治则，并兼有补肾气、降瘀浊、解湿毒的功效。方中柴胡、黄芩为主，枢利少阳三焦湿热；黄芪、益母草、山萸肉益气养阴，补肝肾；丹参、鬼箭羽、萹蓄、白花蛇舌草等清湿热活血解毒。诸药搭配，疏利少阳，扶正祛邪[13]。理学对中药复方深入分析挖掘，阐述肾疏宁防治肾间质纤维化在整体分子水平上的作用机制[15]，研究结果显示肾疏宁可作用于RIF的中药活性成分有130种，相关作用靶基因116个。KEGG分析结果显示肾疏宁防治肾间质纤维化主要作用与TNF、NF-κB、AGE-RAGE 等信号通路有关，尤以 TNF、NF-κB通路密切相关。

TNF-α是参与肾间质纤维化重要的炎症因子之一，能够有效刺激肾小管上皮细胞产生一系列炎症细胞，诱导肾小管上皮转分化或凋亡，加速肾间质纤维化发展。TNF-α还能通过刺激NF-κB通路将其活化诱导细胞的表型转化[16]。被激活的NF-κB反过来促进TNF-α的形成，使NF-κB与TNF-α形成反馈环[17]。NF-κB作为炎性反应基因，在肾小球细胞、肾小球上皮细胞和肾小管上皮细胞中均有表达[18]，被激活后能产生更多的炎性因子，发生炎症反应，促进肾纤维化的发展。另外，NF-κB还可诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化，也可导致纤维化形成。AGE-RAGE信号通路是通过促进肾脏的炎症反应和纤维化过程，促使肾脏结构损伤，最终导致肾功能丧失。AGE-RAGE通路可通过诱导NF-κB的激活和氧化应激作用，进一步刺激促炎细胞因子产生。

研究发现转化生长因子-β（TGF-β）的表达随着NF-κB的活化而升高[14]，TGF-β1目前被认为是肾间质纤维化过程中最关键的生长因子之一，TGF-β1是EMT过程的主要诱导因子，对肾间质纤维化发生、发展的多个环节有重要影响。通过研究可得肾疏宁可能主要通过调节TNF蛋白靶点激活NF-κB通路，减少炎性因子和纤维形成因子产生[15]，同时也会调节TGF-β/Smad信号通路，从而减少肌成纤维细胞数量，调节ECM的表达，减少细胞炎性损伤，抑制炎症反应和纤维化过程，起到治疗肾间质纤维化的作用。

为了进一步验证肾疏宁对RIF治疗作用的药效物质基础，本研究对肾疏宁的核心化合物与TNF、RELA进行分子对接分析，可见核心活性化合物均能与TNF、RELA通过氢键等作用稳定结合。氢键是稳定对接体系的重要作用力[19]，核心活性化合物与TNF、RELA结合均有氢键形成。一般认为，结合能绝对值大于5 kcal/mol表明化合物与靶点蛋白之间结合活性较好；绝对值大于7.0 kcal/mol表明小分子与受体蛋白具有很强的结合活性[20]。分子对接结果显示山奈酚与TNF结合能绝对值为8 kcal/mol，丹参酮与TNF结合能绝对值为8.3 kcal/mol，异鼠李素与TNF结合能绝对值为8.3 kcal/mol，异鼠李素与RELA结合能绝对值为8.3 kcal/mol。值得一提的是，豆甾醇与TNF结合能绝对值为10 kcal/mol，豆甾醇与RELA结合能绝对值为9.7 kcal/mol。根据研究结果考虑豆甾醇在调节RIF过程中发挥重要作用。汤利华等[21]研究发现，山奈酚可降低TNF-α等的表达，使炎性细胞浸润降低，缓解肾组织损伤。研究结果显示丹参酮可通过改变TGF-β/Smad和NF-κB通路的表达来抑制RIF和炎症反应[22]。田锋等[23]认为异鼠李素其作用机制可能是抑制了NF-κB信号转导系统的过度活化及氧化应激。同时肾疏宁中多种活性成分都对RELA表达产生影响，通过抑制NF-κB的蛋白表达，减少炎症反应，从而达到防治肾间质纤维化的目的。

本研究利用网络药理学与分子对接技术，分析了肾疏宁治疗肾间质纤维化的作用机制，揭示了肾疏宁防治RIF可能的相关信号通路、靶点蛋白及活性化合物，为临床慢性肾脏病的防治和后续深入研究奠定了理论基础。但由于网络药理学分析方式存在局限性、中药复方较复杂、药物间相互作用不明确及体内代谢差异等的影响，无法明确中药成分的全部药理作用，还需要临床试验和动物试验来进一步验证。