荧光定量PCR在肺炎支原体感染早期诊断中的价值探索

肖志刚 肖宗浩 刘海欧 陈爱萍 罗舜燕 庄宇嫦

[摘要]目的：探讨荧光定量PCR检测肺炎支原体（MP）-DNA早期诊断MP感染的价值。方法：选取2018年10月至2019年11月本院187例确诊为肺炎疾病的患儿，分别采用荧光定量PCR检测MP-DNA和酶联免疫吸附法检测血清免疫球蛋白M（MP-IgM）。观察两种检查方法不同时间检测阳性率，两种方法及联合检测对不同年龄段患儿的检测阳性率。结果：MP-DNA和联合检测入组时，MP感染阳性率高于MP-IgM检测，差异有统计学意义（P<0.05）;入组1周、2周时，MP-DNA和联合检测MP感染阳性率高于MP-IgM检测，但差异均无统计学意义（P>0.05）。MP-DNA、MP-IgM及联合检测的年龄<4岁、4～7岁、7～10岁和≥10岁患儿最终MP感染阳性率相比差异均无统计学意义（P>0.05）。进一步分析显示，联合检测高于MP-DNA检测的年龄主要在<4岁和4～7岁，但差异无统计学意义（P>0.05）。结论：荧光定量PCR检测MP-DNA早期诊断MP感染的价值不低于MP-DNA和MP-IgM联合检测。

[关键词]肺炎支原体;脱氧核糖核酸;聚合酶链反应

[中图分类号]R725.6.

[文献标识码]A.

[文章编号]2096-5249（2022）02-0001-04

肺炎支原体（mycoplasma?pneumaniae，MP）是急性呼吸道感染、支气管炎、哮喘等的常见病原体，是儿童社区获得性肺炎的重要病原体，MP肺炎占住院儿童社区获得性肺炎的10%～40%[1]。MP感染除呼吸道表现外，还可导致心肌炎、脑炎、肾炎等多种肺外并发症及肺坏死，早期诊断、早期干预对预防重症及减少并发症有重要作用。MP肺炎临床症状和特征与其他肺部感染相似，临床易出现误诊，或仅仅依靠临床症状体征难以与病毒、细菌、结核感染相互区别，需要借助临床检验才能完成早期诊断。MP的常用病原学检测方法包括MP培养和分离及MP血清学检测。MP生长缓慢，一般培养法不能满足临床快速诊断需求，血清学检测MP血清球蛋白M抗体（MP-IgM）受病程的影响，具有一定的临床局限性。研究发现早期感染患儿要在病程1周后才能检出IgM，而且患儿免疫系统发育不完善，也会导致其抗体生产能力受限，提高检测方案的假阴性率，影响临床疾病判断，降低治疗效果。近年来分子检测技术广泛用于MP诊断，包括普通聚合酶链反应（PCR）、反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）等，可快速检测到体内微量MP-DNA，其敏感性和特异性高，MP-DNA阳性率不受病程、是否达到高峰及感染程度的影响，在发病初期对MP患儿即具有诊断价值[2]。本研究通过对187例肺炎患儿同时采用MP-DNA和MP-IgM检测，进一步探讨MP-DNA检测在小儿肺炎诊断中的应用价值，并尝试观察MP-DNA和MP-IgM联合应用的诊断现将结果报告如下。

1对象与方法

1.1研究对象

选择2018年10月至2019年11月在梅州市妇幼保健计划生育服务中心儿科就诊的187例肺炎患儿作为研究对象。187例患儿中，男99例，女88例;年龄3个月～13.4岁（5.63±2.78）岁;病程4h～7d（2.13±1.09）d;体温（39.23±0.52）°C。

纳入标准：（1）年龄1个月～14岁，性别不限;（2）符合《实用儿科学》[3]中呼吸道感染的诊断标准，发病至入院时间≤7d，入院前未接受过抗生素治疗;（3）患儿监护人对研究知情并签署知情同意书。

排除标准：（1）合并免疫缺陷、严重贫血、肺结核、恶性肿瘤、先天性支气管肺发育不良等疾病者;（2）精神疾病、认知功能障碍患儿;（3）严重心、肝、肾等功能不全者。

1.2研究方法

患儿于入院当日、入院后1周、入院后2周采用无菌咽拭子擦拭咽喉壁，利用荧光定量PCR检测拭取物，采用ABI-7500荧光定量PCR仪检测，试剂盒购自上海威正翔禹生物科技有限公司。分别于入院当日、入院后1周、入院后2周抽取患儿静脉血，采用酶联免疫法检测MP-IgM，阳性判定标准为s/co值≥1.1定义为阳性。患儿明确诊断后给予抗支原体治疗，治疗方法包括休息、呼吸道隔离、积极化痰止咳、保持呼吸道通畅、必要时进行雾化吸入，抗生素选择阿奇霉素10mg/（kg·d），5d为1个疗程，6个月以下采用口服阿奇霉素，抗感染疗程持续10～14d，部分难治性病例抗生素延长至3周。

1.3观察指标

（1）观察两种检查方法不同时间检测阳性率;（2）观察两种方法及联合检测对不同年龄段患儿的检测阳性率，联合检测阳性定义为MP-DNA或MP-IgM之一阳性。

1.4统计学方法

采用SPSS23.0进行统计学数据分析。计量资料—采用（x±s）表示，行t检验;计数资料采用[n（%）]表示，行χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。2结果

2.1不同检测方法MP感染检测情况比较

MP-DNA和联合检测入组时MP感染阳性率高于MP-IgM檢测，差异有统计学意义（P<0.05）;入组1周、2周时MP-DNA和联合检测MP感染阳性率高于MP-IgM检测，但差异均无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.2不同检测方法在患儿不同年龄阶段最终MP感染阳性率的比较

MP-DNA、MP-IgM及联合检测的<4岁、4～7岁、7～10岁和≥10岁患儿最终MP感染阳性率相比差异均无统计学意义（P>0.05）。进一步分析显示，联合检测高于MP-DNA检测的年龄主要在<4岁和4～7岁，差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

3讨论

现阶段，随着临床对于肺炎疾病研究程度的加深，发现疾病产生的一项重要因素为病原体支原体感染，目前支原体病菌类型已达11种，能够造成人体呼吸系统损伤的病原体主要为MP病菌。该类病菌细胞结构独特，其外无细胞壁结构，因此更易通过滤菌器，含有RNA、DNA两种结构，通过循环代谢产生生长所需能量。支原体的传播方式较多，唾液、飞沫均会造成致病菌传播，引起患者呼吸道感染疾病。受致病菌作用，大部分患者还会出现炎症病灶，使得呼吸道分泌物进一步增多，造成患者排痰困难或支气管堵塞。

MP肺炎约占社区获得性肺炎的40%和住院患者的18%，如未得到及时治疗，可导致一系列并发症发生，严重影响患儿的身心健康。MP肺炎可发生于各个季节，多为亚急性发作，主要表现为咳嗽、咽痛、头痛等临床症状，易发生肺外播散，任何器官均可累加及，临床报道的肺外表现包括自身免疫性溶血性贫血、非特异性肌痛或关节痛、心肌炎、心律失常、心功能不全等，严重者可并发中枢或外周神经系统病变，甚至可导致死亡。小儿MP肺炎缺乏特异性临床症状，其临床症状与细菌或病毒感染引起的呼吸道感染相似，易导致被忽视、误诊和延误治疗。研究显示[4]，延误治疗可导致约10.9%的MP肺炎患儿需要机械通气，3%～4%的患儿出现急性呼吸窘迫综合征。研究显示，非典型肺炎支原体感染患儿经验性用药存在明显缺点。近年来，儿童MP肺炎呈现新的特点，临床上不断有MP感染的报道，使用“重症肺炎支原体肺炎”“难治性肺炎支原体肺炎”“大环内酯类耐药肺炎支原体肺炎”等名称[5]，给MP感染的临床治疗带来新的问题和难点。因此早期、快速、敏感的诊断MP，对针对性用药、预防MP引发的并发症及减少MP感染的大规模爆发等具有现实的意义。

传统的MP检测主要依靠分离培养法和免疫学方法检测抗原或抗体。经典分离培养法是临床诊断主要依据，其主要是对咽拭子、气道吸出物、胸腔穿刺液和肺泡灌洗液进行MP的分离培养。MP大小一般在0.2～0.3μM，内含一个环状双链DNA，可在固体培养基上形成“荷包蛋”样菌洛，但MP基因组的大小仅为大肠埃希菌的1/6，故其生物合成和代谢能力，需从外界摄取各种基础养分，人工培养营养要求高。临床标本中MP含量低，易污染，分离培养时间长，在体外生长缓慢，判定结果需要3～4周，阳性率低，缺乏早期诊断的价值。MP-IgM抗体是MP感染后机体最早产生的抗体，但其形成仍需要一定时间，多于感染1周左右可检测到，3～4周达到高峰，可持续数月，但婴幼儿免疫功能相对低下，抗体产生较弱，早期诊断也比较困难。同时免疫学方法检测时，因MP与其他支原体存在共同抗原，可导致非特异性交叉反应，降低了诊断的特异性[6]。近年来，分子诊断的方法因其特异性高，敏感性好，在MP的临床检测方面具有较大优势。

MPM129株基因组有816394bp，含677个开放阅读框，39个RNA编码基因，G+C含量为40%，MP基因组具有偏嗜性，照常使用的编码是AUU、AAA、UUU、GAA和UUA，最少使用的编码是UGC、CGA、AGG、UGU。MPPCR检测的靶序列常选在16rRNA基因组可变区与保守区、特异的染色体片段、P1蛋白基因区敏感性和稳定性高，但存在基因高效扩增造成扩增产物污染而导致假阳性的可能[7]。近年来，以标记特异性荧光探针为特点的荧光定量PCR逐步用于MP-DNA检测，采用完全闭管式操作，减少了扩增产物污染的机会，提高了检测特异性，并可对扩增产物进行精确定量分析[8]。杨文青等[9]对742例患儿进行荧光定量PCR检测MP-DNA，结果提示荧光定量PCR法检测患儿MP-DNA水平，具有高敏感性、高特异性、检测迅速和不存在交叉反应等特点，可作为早期MP感染的诊断方法。钟伟明等[10]研究则显示，采用荧光定量PCR法检测MP-DNA既有利于MP感染的早期诊断，又可提高诊断的准确性。张志英等[11]研究显示，在对213例疑似患儿进行检查，发现痰液MP-DNA检测准确率要优于血清MP-IgM抗体检测准确率，联合运用后特异性、敏感性、阴性预测值均较高。本课题组前期研究显示，MP-DNA对MP的早期检测具有积极意义[12]。本研究结果显示，MP-DNA入组时检测阳性率高于对照组，与既往研究一致。MP-DNA和MP-IgM联合检测在入组检出率显著高于单独MP-IgM检测，在入组时、1周、2周联合检测与MP-DNA单独检测无显著差异;年龄分层分析显示，联合检测主要在年龄<7岁以下儿童中阳性率高于MP-DNA，提示荧光定量PCR检测MP-DNA检测的阳性率不低于联合检测，对年龄<7岁的儿童可考虑联合检测。

综上所述，本研究结果提示荧光定量PCR检测MP-DNA早期诊断MP感染的价值不低于MP-DNA和MP-IgM联合检测，可作为年龄≥7岁儿童的主要检测手段，对年龄<7岁儿童为减少漏诊，可考虑MP-DNA和MP-IgM联合检测。

参考文献

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