泌乳阶段和处理温度对驴乳中溶菌酶活性的影响

王 涵，胡玉玲，赵晨坤，杨志鹏，曾申明*

(1.中国农业大学动物科技学院，北京 100193；2.张家口桑阳牧业有限公司，张家口 075831)

溶菌酶(lysozyme)是一种糖苷水解酶，能催化细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键水解，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂，内容物逸出而使细菌溶解[1]。溶菌酶作为机体天然免疫系统的一部分，存在于多种分泌物(眼泪、唾液、尿液、黏液和乳汁等)中，也可由巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞合成并分泌[2]。在体外试验中，溶菌酶显示出抗酸性并且能够不被人体肠道酶类降解[3]。同时，溶菌酶也具有抗炎及抗肿瘤作用[4-6]。Jiang等[7]报道了口服驴乳溶菌酶可改善结肠炎小鼠的体重减轻、结肠损伤和黏膜炎等症状。Ozturkoglu-Budak等[8]将驴乳中提取的溶菌酶和乳铁蛋白作为天然的食品添加剂添加到奶酪中可以减少其中的微生物含量并提升产品质量。通过蛋白质含量测定发现，非反刍动物的乳汁中溶菌酶的含量显著高于反刍动物，牛奶、羊奶中的溶菌酶含量极低，而驴乳中富含溶菌酶且其含量高于人乳[9]。因此，富含溶菌酶的驴乳可作为一种珍贵的保健品供人们饮用。另外，研究认为驴乳可作为人乳珍贵的替代品，而且可以代替牛奶来减少过敏情况的发生[10-12]。人们通常认为马属动物的泌乳期为6个月，而在实际生产中，如不采取断奶措施，母驴分娩后第10个月仍可泌乳。Martini等[13]检测了第3、6、9泌乳月驴乳中的溶菌酶活性，Pilla等[14]从0～8月每隔2个月检测一次驴乳中的溶菌酶活性。但目前母驴一个泌乳周期的不同泌乳阶段以及泌乳水平对乳中溶菌酶活性的影响尚不清楚。

巴氏灭菌法常用来加工生乳以延长其保质期，它是指将乳加热到62～65 ℃并保持30 min或者加热到75～90 ℃并保持15～16 s[15]。而常温保存奶通常使用超高温瞬时灭菌技术，即将鲜奶在封闭系统中加热到120 ℃以上并持续几秒钟后，迅速冷却至室温的一种杀菌方法，用此方法能使生乳保质期延长至6个月。前人通过测定冻干[16]、新鲜、冷冻[17]、超高压均质和巴氏杀菌[18]驴奶中溶菌酶的酶活性，发现较高的加工温度不适合维持驴乳的溶菌酶活性。然而，不同的研究得出的结论并不一致，有人发现驴乳分别在75 ℃和85 ℃[18]、90 ℃[19]加热1 min对溶菌酶活性无显著影响，而Polidori和Vincenzetti[17]指出，当加工温度高于70 ℃时溶菌酶开始失活。因此，何种处理温度能最大程度保留驴乳中的溶菌酶活性是驴乳加工过程中急待解决的问题。

针对以上问题，本试验主要研究母驴在同一泌乳周期的不同泌乳阶段、不同泌乳水平和不同加工温度对驴乳中溶菌酶活性的影响，旨在为驴乳生产和加工技术研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及乳样采集

本试验是在张家口桑阳牧业有限公司实施，试验动物为阳原驴，年龄为4～9岁。

根据母驴日平均产奶量水平分为低(400 g以下)、中(400～1 000 g)、高(1 000 g以上)3组，每组随机挑选3头作为试验动物。从母驴产驹后第3个月的第1天开始，连续取样7 d，到第10个泌乳月结束。挤奶前母驴与驴驹在每天固定的时间进行隔离，第2～6个泌乳月母仔在挤奶前分离4 h，从第7～10个泌乳月开始母仔在挤奶前分离7 h，每天定时在下午3点挤奶取样。试验中的新鲜牛、绵羊乳均取自附近的牧场的混合乳样，连续取样3 d。本试验使用的混合乳样均为从牧场中所有泌乳母畜的混合乳中取到的乳样。采集到的乳样置于经高压蒸汽灭菌的洁净带盖子的离心管中，4 ℃保存，于取样当天测定溶菌酶活性。

1.2 驴乳的热处理方法

将当天采集到的每头母驴的乳样混合后进行不同温度的巴氏灭菌处理(HH-2数显恒温水浴锅，常州越新仪器制造有限公司)。混合乳样分为6份，其中1份为生乳，其余5份分别于62 ℃加热30 min，72、77、82、87 ℃分别加热15 s，加热处理后的奶样立刻冷却至室温后进行溶菌酶活性的检测，重复5 d。

1.3 溶菌酶活性检测方法

溶菌酶活性检测按照试剂盒(Sigma，LY0100)说明书进行，本试验采用的检测方法是在比浊法的基础上经改良后适用于乳中溶菌酶活性的检测，简要来说，将采集到的乳样进行2 000 r·min-1离心15 min，即脱脂处理，取适量上清液用反应缓冲液稀释30倍后进行测定。将721型可见光分光光度计(721G可见光分光光度计，上海仪电科学仪器股份有限公司)提前打开预热，称取适量的溶壁微球菌冻干粉末于洁净试管中，加入平衡至室温的反应缓冲液进行稀释，使其在450 nm处的吸光度为0.6～0.7。测定时先在比色皿中加入2 mL反应缓冲液对分光光度计进行调零，另取两只比色皿分别加入2 mL菌液，读取此时的吸光度数值为A4500 min，然后分别加入75 μL的反应缓冲液以及乳样稀释液，分别作为空白对照组及试验组，迅速混匀，反应2 min后再次读取吸光度数值为A4502 min，最后根据如下公式进行计算即可得出该乳样中的溶菌酶活性。

酶活计算公式：

ΔA450/min Test=

试验组(A4500 min-A4502 min)/2；

ΔA450/min Blank=

空白对照组(A4500 min-A4502 min)/2；

奶样稀释倍数为30；0.001为一个溶菌酶活性单位；加入奶样的体积为0.075 mL；2指反应时间2 min。

活性单位定义：一个单位表示在25 ℃，pH6.24的条件下，以溶壁微球菌为底物，ΔA450每分钟改变0.001。本试验中溶菌酶活性均以“U·mL-1”表示。

每个乳样都设两次技术重复，取两次试验结果的平均值作为该乳样的溶菌酶活性值。

1.4 统计分析

本试验中的数据使用SPSS 23.0软件进行统计分析，结果以“平均值±标准差”表示，方差齐性检验。采用单因素方差分析(ANOVA)进行组间两两比较(LSD)，检验水平以P<0.05为差异显著。

2 结 果

2.1 驴乳、牛乳、绵羊乳中溶菌酶活性的比较

驴、牛、绵羊鲜乳中溶菌酶活性值见表1，结果显示驴乳中溶菌酶活性显著高于牛、羊乳(P<0.05)，而后两者间无显著差异(P>0.05)。该部分试验中所用的乳样均为连续3 d在试验当天从各个牧场(母驴35头、奶牛20头、绵羊32只)取得的混合新鲜乳样。

表1 奶牛、绵羊和驴乳中的溶菌酶活性比较

2.2 母驴不同泌乳月对驴乳中溶菌酶活性的影响

不同泌乳月驴乳中的溶菌酶活性见表2，结果显示以泌乳月划分，3、5、8、9、10月间溶菌酶活性无显著差异(P>0.05)，但皆显著高于4、6、7月(P<0.05)，其中第7个泌乳月驴乳中溶菌酶活性最低，第8个泌乳月最高。

表2 母驴不同泌乳月对乳中溶菌酶活性的影响

2.3 日均泌乳水平对溶菌酶活性的影响

表3结果显示，日均泌乳水平对溶菌酶活性无显著影响(P>0.05)，且高产母驴同时具有较高溶菌酶活性的趋势。

表3 不同泌乳水平的母驴乳中溶菌酶活性的比较

2.4 不同处理温度对驴乳中溶菌酶活性的影响

生驴乳经过不同温度的热处理后，溶菌酶活性的变化如图1所示，其中，62 ℃加热30 min后，溶菌酶活性与生乳无显著差异(P>0.05)，而且有升高的趋势。但当温度升高至72 ℃时，溶菌酶活性开始显著下降(P<0.05)，在77～87 ℃范围内，溶菌酶活性无显著差异(P>0.05)，酶活下降到生乳的35%～45%。

将5份不同天取到的乳样分为6个处理组进行处理

3 讨 论

根据蛋白含量的测定，牛乳(1.02×10-5g·L-1)[20]、羊乳(7.66×10-6g·L-1)[21]中含有极少量的溶菌酶，而马乳(1.03 g·L-1)[22]、驴乳(0.94 g·L-1)[23]和人乳(0.1～0.89 g·L-1)[24]中均含有较多的溶菌酶。本研究通过溶菌酶活性的检测发现，驴乳中的溶菌酶活性显著高于奶牛和绵羊乳，与上述结果基本一致。

前人的研究发现，驴乳中的溶菌酶活性值变化较大。例如，Conte等[25]报道的溶菌酶活性值从5 800 U·mL-1到2 740 U·mL-1，而Pilla等[14]报道的溶菌酶活性水平约为4 000～5 000 U·mL-1，有时高达7 000 U·mL-1。Yvon等[26]报道的溶菌酶活性值水平较高约为17 900 U·mL-1。Addo和Ferragut[18]报道的溶菌酶活性值从11 000 U·mL-1到15 000 U·mL-1，本研究的结果与此报道最为接近。而Martini等[13]检测到的溶菌酶活性较低为1 433～1 842 U·mL-1。出现这种差异可能是由于驴品种、地理位置的不同或者驴乳样品保存方式的不同。尽管有关泌乳阶段对驴乳中溶菌酶活性的影响的研究较少，而且溶菌酶活性数值相差较大，但都发现溶菌酶活性在不同的泌乳月份表现出差异。Martini等[13]的研究结果显示，第3个泌乳月驴乳中溶菌酶活性最高，而第6月最低；Pilla等[14]检测出第6～8月最低，0～6以及8月以上无明显差异。本研究的结果是第6、7月最低，其他月份无显著差异。这3项研究结果基本一致，即在泌乳过程中驴乳中溶菌酶活性存在波动，因此需要进一步的研究确定引起驴乳中溶菌酶活性变化的原因。Lönnerdal等[27]的研究发现，人乳中溶菌酶浓度与泌乳阶段有关，初乳中溶菌酶的浓度最低，以后逐渐增加，在31～60天达到峰值，随后下降。而在另外的一项研究中，初乳中溶菌酶浓度较高，在分娩后的第1个月逐渐下降，随后开始上升并在第57～84天达到峰值[28]。Koenig等[29]报道，人初乳中的溶菌酶浓度较低，并在泌乳过程中逐渐增加，母乳中溶菌酶的浓度在哺乳第2个月后显著增加，提示这种酶在哺乳后期抵抗感染中起着重要作用。本研究结果显示，母驴在整个泌乳期间驴乳中的溶菌酶活性一直维持在较高水平，受泌乳阶段的影响较小。

本研究发现，驴乳中溶菌酶活性不受母驴产奶性能高低的影响，而且存在产奶量和溶菌酶活性都较高的母驴，这些母驴可作为优良的遗传资源，可对其溶菌酶合成相关基因进行研究，筛选出相关分子标记，以培育可稳定遗传该优良性状的母驴品系。

驴乳中的溶菌酶作为一种重要的活性物质，在加工处理时需要被保留下来。溶菌酶通常是耐热的，只有在高温处理时才出现变性，Polidori和Vincenzetti[17]指出，溶菌酶在4～50 ℃具有很好的热稳定性，当温度高于70 ℃时，溶菌酶开始变性失活。有人检测了新鲜和处理过的驴奶以及冷冻储存期间溶菌酶含量和活性的变化。Vincenzetti 等[16]提到，鲜奶中的溶菌酶含量高于相同的冻干样品。驴乳溶菌酶的热稳定性也被其他研究人员不同程度地证实。巴氏杀菌(63 ℃，30 min)对溶菌酶的抗菌活性没有显著影响[30]。而Sousa等[31]的研究中指出，62.5 ℃加热30 min会导致人乳中高达44%溶菌酶活性的大量流失。Coppola等[19]发现，90 ℃处理1 min对驴乳溶菌酶活性无显著影响，而在121 ℃处理10 min后溶菌酶失活。Addo和Ferragut[18]将生驴乳分别在75、85 ℃加热1 min，并在4 ℃保存28 d，期间每7 d检测一次溶菌酶活性，发现75、85 ℃加热1 min对溶菌酶活性无显著影响。在本研究中，62 ℃处理30 min的驴乳可最大程度保留溶菌酶的活性，且高于生乳中的酶活性，有可能是因为高温处理能在一定程度上激活溶菌酶。当温度上升至72 ℃时，溶菌酶活性开始出现下降，但仍然具有较高的活性，但当温度升高至77～87 ℃加热15 s时，溶菌酶活性下降至生乳的35%～45%。出现这些差异的原因还不清楚，本试验不是在工业化生产条件下进行，在样品处理过程中可能会出现乳样局部热处理时间过长而影响酶活性。

从本研究的结果来看，为维持驴乳中溶菌酶活性的稳定，最理想的热处理条件是62 ℃处理30 min。然而，在生产实际中该加工方法成本高、保质期短且要求4 ℃冷藏运输，因此驴乳产业急需一种或多种乳加工方式来保持溶菌酶的活性而降低有害菌的数量，如采用膜过滤和超高压均质技术等。

4 结 论

驴乳中溶菌酶的活性较高，且不受泌乳阶段和泌乳量水平的影响；驴乳在62 ℃处理30 min对其中溶菌酶活性无影响，可为乳品加工工艺的设计提供参考。