球孢白僵菌GqBb 的分离、鉴定及其对松果梢斑螟幼虫的致病性研究

刘志佳，李文静，程曼曼，张晓飞，李继泉，崔建州

（河北农业大学 林学院/河北省林木种质资源与森林保护重点实验室，河北 保定 071000）

松果梢斑螟 （Dioryctria pryeri）是一种为害严重的钻蛀类害虫，主要以幼虫危害油松（Pinus tabuliformis）、华山松（Pinus armandii）、马尾松（Pinus massoniana）等松科植物的当年生幼嫩枝梢和1 ～2 年生球果［1-2］。新梢被害后，逐渐枯萎，极易折断，影响树木生长发育；球果被害后，畸形枯死，影响种子的产量和质量，不仅造成经济损失，同时也破坏了天然松树林的自然更新［3-5］。

目前，松果梢斑螟防控主要采用化学农药防治［6-7］。化学农药的喷施不仅会使昆虫产生抗药性，还会导致环境污染，对人畜和其他生物造成伤害。因此，选择安全、无污染、对害虫有持续作用的生物农药进行防治很有必要［8-9］。

白僵菌（Beauveria）是研究最早的一种昆虫病原微生物［10-11］，具有无毒无污染、适应环境能力强、寄生范围广等特点［9-12］，对鳞翅目（Lepidoptera）、鞘翅目（Coleoptera）、膜翅目（Hymenoptera）等700 余种昆虫有一定的致病性［13］，在生物防治领域发挥着至关重要的作用［10］。然而，有关白僵菌对松果梢斑螟的致病性研究尚未见报道。为此，本研究分离纯化采自秦皇岛北戴河区自然感病死亡的松果梢斑螟幼虫僵体病原物，通过形态学和ITS 序列分析鉴定菌种，采用喷雾法测定其孢悬液对松果梢斑螟幼虫的致病性，以期为松果梢斑螟的生物防治提供新的菌株资源和理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供 试 菌 株： 秦 皇 岛 北 戴 河 区（119.48°E，39.83°N）被松果梢斑螟为害的油松球果中，偶然发现1 头被白僵菌侵染死亡的松果梢斑螟幼虫僵体，经实验室分离得到该菌株。

松果梢斑螟幼虫：采集河北省涞源县大龙门省级森林公园被松果梢斑螟危害的油松球果，实验室内从被害球果中取出幼虫，并区分虫龄后将同一虫龄幼虫放入装有新鲜油松球果的广口瓶（250 mL）中，每瓶10 头幼虫，双层纱布封口， 15 ℃恒温培养箱中培养备用。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：葡萄糖（10.0 g）、蛋白胨（5.0 g）、琼脂（18.0 g）、磷酸二氢钾（1.0 g）、七水合硫酸镁（0.5 g）、蒸馏水（900 mL）。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株分离培养 将白僵菌侵染的松果梢斑螟幼虫僵体，75%酒精浸泡30 s 后，无菌水冲洗3 次，吸水纸吸去多余水分。将僵虫体接种到PDA 平板（Φ = 90 mm）上，封口膜封口，防止杂菌污染，25 ℃ 恒温培养箱中培养。待长出菌丝后，挑取菌落边缘新鲜、无污染菌丝，接种到新的PDA 平板上，重复此操作至不再有杂菌长出，得到纯化菌株。

1.2.2 菌株形态学及分子生物学鉴定 根据真菌鉴定手册，光学显微镜观察菌落形态、产孢结构和分生孢子形态，进行形态学鉴定。

菌株DNA 提取参照试剂盒说明书（北京Aidlab 生物科技有限公司）。选用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行PCR 扩增［14］。PCR 扩增体系为50.0 μL，其中模板DNA（20.0 ng/μL）1.0 μL，上下游引物各1.5 μL，10×Buffer（含2.5 mmol/L Mg2+）5.0 μL，Taq 聚合酶（5.0 U/μL）1.0 μL，dNTP（10 mmol/L）1.0 μL，ddH2O 39.0 μL。扩增反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环；72 ℃终延伸7 min。反应完成后，取PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送上海派森诺生物科技有限公司测序。

1.2.3 孢子悬浮液配制 用含1‰吐温80 的无菌水冲洗培养20 d 的Gq-Bb 菌株平板，冲洗液于三角瓶（500 mL）中充分混合，3 层无菌纱布过滤，显微镜下利用血球计数板计算孢悬液浓度。用含1‰吐温 80 的无菌水稀释，制备成浓度分别为1×104、1×105、1×106、1×107、1×108孢子/mL 的孢悬液，待用。

1.2.4 菌株对松果梢斑螟幼虫致病性测定 挑选健康、活跃的各龄幼虫，采用喷雾法进行其致病性测定。将同一虫龄幼虫放入培养皿（Φ =90 mm）中，孢悬液均匀喷洒在培养皿，20 s 后用洁净的滤纸吸去多余的孢悬液，然后将幼虫放入装有新鲜油松球果的广口瓶（250 mL）中， 25 ℃恒温培养箱中培养。每24 h 观察1 次，记录死亡个体数量，至不再有幼虫死亡。以含1‰吐温 80 的无菌水为对照，每个浓度处理50 头试虫，重复3 次。

将死亡幼虫置于平面载玻片上，放入湿润棉球保湿的培养皿中，25 ℃、75% RH 的恒温培养箱中培养，凡有白僵菌菌株长出者计为有效死亡。

1.2.5 数据处理 Excel 整理各处理幼虫的累积死亡率，运用SPSS 21 软件进行分析，计算累计校正死亡率。采用Probity 模型计算致死中浓度（LC50），求回归方程及计算致死中时（LT50）。

2 结果与分析

2.1 Gq-Bb 菌株形态学及分子生物学鉴定

菌落生长初期为乳白色绒毛状，后略显黄色，孢子层较厚（图1 A）；背面呈淡黄色（图1 B）。菌丝近无色，分生孢子为光滑球形或近球形，多簇生于菌丝末端（图1 C）。

使用PCR 扩增目的菌株的rDNA-ITS 序列片段的测序结果为525 bp：CTGATTCGAGGT CACGTTCAGAAGTTGGGTGTTTTACGGCGTGGC CGCGTCGGGGTCCCGGTGCGAGCTGTATTACTG CGCAGAGGTCGCCGCGGACGGGCCGCCACTCC ATTTCAGGGCCGGCGGTGTGCTGCCGGTCCCCA ACGCCGACCTCCCCAAGGGGAGGTCGAGGGTT GAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGA ATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTC GATGATTCACTGGATTCTGCAATTCACATTACTT ATCGCGTTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAG AGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTC ATTTGTTTTGCCTTGCGGCGTATTCAGAAGATG CTGGAATACAAGAGTTTGAGGTCCCCGGCGGG CCGCTGGTCCAGTCCGCGTCCGGGCTGGGGCG AGTCCGCCGAAGCAACGATAGGTAGGTTCACA GAAGGGTTAGGGAGTTGAAAACTCGGTAATGA TCCCTCCGCAGGTTCACCTACGGA。

将该序列与NCBI 核酸数据库中的数据进行比对，发现该菌株与球孢白僵菌的相似度为100%，结合形态学鉴定结果，最终确定该菌株为球孢白僵菌，编号Gq-Bb 菌株。

2.2 感染球孢白僵菌Gq-Bb 的松果梢斑螟幼虫症状

松果梢斑螟各龄幼虫均可被Gq-Bb 菌株感染（图2）感侵染初期幼虫行动力减弱，取食量下降，身体出现不同程度的皱缩。随侵染时间延长，病原真菌逐渐在虫体内生长扩散，幼虫体表出现大小不一的黑色斑点并逐渐扩大，至整个虫体变黑褐色后幼虫死亡，虫体僵硬。僵虫体表面1 ～2 d 后开始出现白色絮状菌丝，再经过2 ～4 d 菌丝长满僵虫体表，剖开的幼虫体内也存在大量菌丝。从松果梢斑螟被感染至长出菌丝产出孢子，最短约7 d，最长约11 d。

图2 松果梢斑螟幼虫感染症状Fig.2 External symptoms of larvae of Dioryctria pryeri after infection treatment

2.3 球孢白僵菌Gq-Bb 对松果梢斑螟幼虫的致病力

2.3.1 松果梢斑螟幼虫的累积死亡率 由表1可知，球孢白僵菌Gq-Bb 可侵染5 个龄级的松果梢斑螟幼虫，随孢子浓度的升高各龄级幼虫的累计校正死亡率逐渐升高，高龄幼虫的累计死亡率低于低龄幼虫。同时，随侵染时间的推移幼虫的累积死亡率逐渐升高，第6 d 时累积死亡率达到最大。感染第6 d时，孢悬液浓度1×107孢子/mL 和1×108孢子/mL较1×104孢 子/mL、1×105孢 子/mL 和1×106孢子/mL 其1 龄和2 龄幼虫差异显著，孢悬液浓度1×108孢子/mL 较1×104孢子/mL、1×105孢子/mL和1×106孢 子/mL 其3 龄 和4 龄 幼 虫 差 异 显 著（P＜0.05）， 孢 悬 液 浓 度1×108孢 子/mL 较1×104孢子/mL、1×105孢子/mL 、1×106孢子/mL和1×107孢子/mL 其5 龄幼虫差异显著；孢子浓度为1×106孢子/mL、1×107孢子/mL 和1×108孢子/mL 时，1 龄、2 龄和3 龄幼虫较4 龄和5 龄幼虫的累积死亡率有显著差异，1×104孢子/mL 和1×105孢子/mL 时各龄幼虫的累积死亡率没有显著差异（P＞0.05）。

表1 不同浓度孢子悬浮液处理的各龄级松果梢斑螟幼虫的累积死亡率Table 1 Cumulative mortality of Dioryctria pryeri larvae in various instars treated with different concentrations of spore suspension

2.3.2 球孢白僵菌Gq-Bb 对松果梢斑螟幼虫的致死浓度效应 应用Probity 模型对松果梢斑螟幼虫死亡率进行处理，计算其1 ～5 龄幼虫的致死中浓度（LC50）分别为1.26×103、1.90×103、2.99×103、2.12×104、2.12×105孢 子/mL（见 表2）。 表 明Gq-Bb 菌株对1 ～3 龄幼虫致病性最强，其次为4 龄，5 龄幼虫致病性最低。

表2 球孢白僵菌Gq-Bb 对松果梢斑螟的致死中浓度Table 2 The median lethal concentration of Beauveria bassiana strain Gq-Bb against Dioryctria pryeri larvae

2.3.3 球孢白僵菌Gq-Bb 对松果梢斑螟幼虫的致死时间效应 随球孢白僵菌Gq-Bb 孢子浓度的增加，松果梢斑螟各龄幼虫的致死中时间（LT50）逐渐缩短；同一浓度下随其龄级增长，LT50逐渐延长（表3）。在1×104～1×108孢子/mL 浓度处理范围中，1 龄幼虫的LT50从4.34 d 降至2.57 d，2 龄幼虫的LT50从4.91 d 降至2.78 d，3 龄幼虫的LT50从5.19 d 降至2.78 d，4 龄幼虫的LT50从5.73 d 降至2.99 d，5龄幼虫的LT50从6.44 d 降至3.64 d。

表3 球孢白僵菌Gq-Bb 对松果梢斑螟的致死中时间（LT50）Table 3 The median lethal time of Beauveria bassiana strain Gq-Bb to dioryctria pryeri larvae

3 结论与讨论

不同菌株对害虫的致病力不同［15］，高效昆虫病原物真菌菌株筛选时，致病力的强弱是衡量该菌株利用价值的重要指标之一。本研究以自然感病的松果梢斑螟幼虫僵体上分离获得的白僵菌Gq-Bb 为研究对象，根据形态学特征及ITS 序列比对分析，鉴定该菌为球孢白僵菌（Beauveria bassiana），发现该菌株对松果梢斑螟各龄幼虫皆有致病能力，但对不同龄级幼虫的致病力存在一定的差异，孢子浓度越高对同一龄级幼虫的致病力越强，孢子浓度相同时对低龄幼虫的致病力更强。这与前人报道的球孢白僵菌对草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）低龄幼虫的致病力更高相类似［16］。尽管菌株Gq-Bb对5 龄幼虫的致死率达到了77.33%，但相对于1、2 龄幼虫的致死率较低，因此，低龄幼虫种群高峰期时施用该菌防治松果梢斑螟防治效果会更好。

致死中浓度（LC50）和致死中时间（LT50）是描述菌株致病性的重要指标，LC50数值越小，目标害虫LT50越短，说明菌株致病力越强。有研究报道，5×109孢子/mL 浓度下3 株球孢白僵菌菌株对粘虫（Mythimna separata）的累积死亡率均达到100%［17］。采用喷雾法对分离自松褐天牛（Monochamus alternatus）的23 株球孢白僵菌成虫杀虫效果显示，1×106孢子/mL 浓度下，仅有6 株球孢白僵菌菌株的校正死亡率达30%以上，其中B10 菌株的校正死亡率最高，为36.7%［18］。选用10 株球孢白僵菌对松果梢斑螟进行高致病菌株筛选，发现A3 和J2 菌株对该螟幼虫的致死率均达100%，其LC50和LT50分别为2.97×105孢子/mL、 4.13 d 和4.18×105孢子/mL、 4.22 d［19］。本研究中，在1×108孢子/mL浓度下，1 龄幼虫的LC50和LT50分别为1.26×103孢子/mL 和2.57 d，5 龄幼虫也仅为2.12×105孢子/mL 和3.64 d，较前者2 株菌株的LC50更低、LT50更短，表明球孢白僵菌Gq-Bb 对松果梢斑螟幼虫具有更强的致病力，有进一步研究的价值。

球孢白僵菌是一类重要的生防菌，具有巨大的研发潜力，但在继代培养过程中，其一些毒素的代谢水平的降低，会导致毒力下降［20］，意味着在其培养过程中，存在退化的可能。因此，如何保持其毒力，在自然环境条件下利用白僵菌制剂进行害虫防治，仍有许多问题需要解决。本研究发现，室内条件下球孢白僵菌Gq-Bb 对松果梢斑螟幼虫具有很强的致病力，但其在田间应用时能否产生同样的效果，特别是如何保证孢子接触虫体并发挥作用，仍需进一步深入研究。