液质联用内标法测定饲料中氯霉素残留量的不确定度评估

高俊峰，陈梦莹，邵 瑞，黄 婷

(国粮武汉科学研究设计院有限公司//国家饲料质量检验检测中心(武汉)，湖北 武汉 430079)

氯霉素是一种常见的广谱抗生素药物,曾广泛用于饲料和养殖行业[1]。有研究证明，氯霉素能通过食物链对人畜健康造成明显危害[2]。随着农业部194号、250号公告的发布，规定氯霉素类药物不得在饲料和动物源性食品中使用和检出[3-4]，因此对氯霉素的准确检测很有必要。我们采用液质联用内标法测定饲料中氯霉素残留量，依据JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》对方法的不确定度进行分析评估[5]，以期在实验过程中控制和避免影响氯霉素含量测定的关键因素，从而提高检测结果的准确性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

TSQ QUANTUM ULTRA超高效液相色谱质谱联用仪,美国赛默飞世尔公司；IKA VORTEX2涡旋混合仪,德国IKA公司；SIGMA 3K15高速冷冻离心机,德国Sigma公司；ASE-12固相萃取仪,天津奥特赛思仪器有限公司；ME104电子天平,瑞士特勒托利多公司；12位氮吹仪,上海安谱实验科技股份有限公司；0.22 μm有机滤膜，天津津腾实验设备有限公司。

氯霉素、氯霉素-D5标准品,北京坛墨质检标准物质中心；乙酸乙酯、甲醇、乙腈、正己烷(色谱纯)，美国BCR试剂公司；甲酸、氨水(色谱纯)，天津科密欧化学试剂公司；饲料样品(氯霉素阴性),国家饲料质量检验检测中心(武汉)；C18固相萃取柱,上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1标准系列溶液配制

氯霉素-D5内标工作液(100 ng/ml)：使用移液器移取100.0 μg/ml氯霉素-D5内标标准溶液(溶剂为甲醇)10 μl于10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度线。

氯霉素标准工作液(100 ng/ml)：使用移液器移取100.0 μg/ml氯霉素标准溶液(溶剂为甲醇)10 μl于10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度线。

标准曲线的制备: 使用移液器移取氯霉素标准工作液和氯霉素-D5内标工作液适量于1 ml容量瓶中，用一级水配置成氯霉素质量浓度分别为1.0、3.0、5.0、10.0和20.0 ng/ml，氯霉素-D5质量浓度为10.0 ng/ml的混标上机液。

1.2.2样品的前处理

参考农业部2483号公告-8-2016中的检测方法[6]。平行称取五份1.1中的饲料样品，每份2 g(准确至0.000 1 g)，置于50 ml具盖离心管中，分别加入100 μl 配制的氯霉素-D5内标工作液、氯霉素标准工作液，再加入0.3 ml氨水、10 ml乙酸乙酯，涡旋2 min后振荡提取10 min，6 000 r/min离心10 min后提取上清液转入氮吹管中，重复上述操作1次，合并2次上清液，45℃水浴氮气吹干。向吹干后的残渣中加入5%甲醇4 ml复溶，再加入4 ml经甲醇-水饱和过的正己烷除脂2次。取用3 ml甲醇、3 ml水活化过的C18萃取柱，上样后用3 ml水淋洗，3 ml甲醇洗脱，收集洗脱液于45℃氮气吹干。用单标线移液管移取1 ml一级水复溶，过0.22 μm有机滤膜后上机待测。

1.3 不确定度评定的数学模型

测定饲料中氯霉素含量的数学模型为：

式中，X为饲料样品中氯霉素残留量，μg/kg；C为从标准曲线中读出的饲料中氯霉素上机液测定质量浓度，μg/L；V为上机液最终定容体积，ml；m为饲料样品质量，g。

2 结果与分析

2.1 不确定度分量的评估

2.1.1标准系列溶液操作引入的不确定度

2.1.1.1标准溶液纯度引入的不确定度

查询标准溶液证书，氯霉素标准溶液、氯霉素-D5内标溶液不确定度为3%，k=2，按均匀分布计算，则2种标液的相对不确定度为：

2.1.1.2标准溶液和内标溶液配制引入的不确定度

(1)容量瓶引入的不确定度

依据JJG 196—2006《常用玻璃器皿检定规程》[7]，20℃下，1 ml和10 ml的容量瓶引入的不确定度计算见表1。

表1 容量瓶引入的不确定度

根据表1可得容量瓶引入的不确定度：

=0.026 517

(2)移液器引入的不确定度

依据JJG 646—2006《移液器检定规程》[8]，同时参考移液器检定证书，将移液器移取3次10 μl甲醇引入的不确定度计算如下：

同理可得出1.2.1标准系列溶液配制过程中移液器移取不同体积、不同次数的标准溶液引入的不确定度，计算如表2。

表2 10～100 μl移液器引入的不确定度

综上，移液器引入的相对标准不确定度：

2.1.2样品前处理引入的不确定度

2.1.2.1称样量引入的不确定度

2.1.2.2添加标准工作液和内标液引入的不确定度

据1.2.2可知，使用10～100 μl移液器分别向5份氯霉素阴性饲料样品中添加了氯霉素标准工作液和氯霉素-D5内标液100 μl，参照表2内容，可得添加标准工作液和内标液引入的相对不确定度：

2.1.2.3配制上机液引入的不确定度

由1.2.2可知，配制上机液使用1 ml单标线移液管5次。依据JJG 196—2006《常用玻璃器皿检定规程》[7]，并查询检定证书，其不确定度计算过程汇总如表3。

表3 1 ml单标线移液管引入的不确定度

根据表3可得1 ml单标线移液管引入的相对标准不确定度：

=0.001 629

2.1.3重复测定引入的不确定度

依据CNAS-GL006—2019《化学分析中不确定度的评估指南》[9]，重复测定引入的不确定度按A类评估，测定的结果见表4。由表4可得标准偏差：

重复测定5次氯霉素平均值的标准不确定度：

样品重复测定引入的相对不确定度：

2.1.4标准曲线拟合引入的不确定度

以氯霉素标准溶液质量浓度值为X轴，氯霉素标液与氯霉素-D5内标物质谱峰面积比值为Y轴，绘制标准曲线，对5个不同质量浓度的标准系列溶液进行拟合测定，其结果如表5所示。

根据表5可得氯霉素标准曲线的拟合标准差为：

表5 氯霉素标准曲线方程及计算结果

=0.011 860

式中，t为标准溶液测定次数(t=5)；Yp代表氯霉素标准工作液与氯霉素-D5内标工作液实测质谱峰面积比值；Y代表Ci通过曲线方程计算出的结果。由此可得标准曲线拟合引入的标准不确定度：

=0.079 631

表4 饲料中氯霉素的重复测定结果

综上，可得标准曲线拟合引入的相对不确定度：

2.2 合成不确定度

由2.1中各分量不确定度的评估结果，得出合成相对标准不确定度为：

=(0.0152+0.0152+0.026 5172+0.046 2092+0.000 0992+0.078 4852+0.001 6292+

饲料中氯霉素含量平均值为5.006 μg/kg ，则合成标准不确定度为：

=0.488 μg/kg

2.3 测量不确定度报告

综合2.1和2.2所述，依据JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》[5]，在95%置信概率下取包含因子k=2，测量结果的扩展不确定度为：U=2×u(X)=2×0.488=0.976 μg/kg。因此，采用液质联用内标法测定饲料中氯霉素残留量的结果表示为：X=(5.01±0.98)μg/kg(k=2)。

3 结论

我们采用液质联用内标法测定饲料中氯霉素的残留量，从标准系列溶液操作、样品前处理、样品重复测定、标准曲线拟合四个方面考虑不确定度的引入及评定，从最终测量不确定度的报告结果看，可以考虑通过选用更高纯度标准品和更高精密度的器具，优化前处理步骤，提高重复测定次数等方面来降低试验结果的不确定度，从而提高实验室测定饲料中氯霉素残留量的准确度。