超高静压对非浓缩还原杨梅果汁中氧化酶的钝化作用

吴新怡，孟梓怡，朱吟非，罗子阳，王超，段翰英

（暨南大学理工学院，广东广州 510632）

杨梅作为我国主要的亚热带水果，果色鲜艳、汁液丰富、酸甜适度、风味独特，深受消费者青睐，具有很高的经济价值和营养价值[1]。果汁、果醋、蜜饯果脯、水果罐头等为杨梅主要的深加工产品，其中杨梅果汁的产量最大[2-4]。NFC果汁是以鲜果为原料，直接经榨汁和杀菌等工序所制得的一种果汁产品[5]。由于其不经过高温浓缩和还原等工序，可最大程度地保持果汁的原有风味、口感和营养价值，健康新鲜，符合当前的消费趋势和市场需求。

目前，NFC及传统果汁的灭菌方式仍以热处理为主，这种方式严重破坏了产品的营养、风味、色泽，导致了非酶褐变、维生素分解和挥发性化合物损失等问题的产生。近年来，以超高静压（HHP）等为主的非热杀菌技术在食品行业中发展迅猛。HHP实现低温灭菌，更大程度地保留了食品感官和营养特性，极大满足了消费者对最少化食品加工的需求。在对NFC橙汁品质影响的研究中发现，相比高温短时杀菌（110 ℃，8.6 s），HHP处理（600 MPa/1 min）对NFC橙汁杀菌效果较好，且对总酚、维生素C、抗氧化活力、天然色泽和感官风味起到了更好的保护作用[6]。

多酚氧化酶（PPO）与过氧化物酶（POD）是影响果汁褐变、品质劣变的主要氧化酶，HHP可钝化酶从而提高果汁品质。Zhang等[7]发现HHP处理能通过钝化PPO与POD的活性，从而显著降低西瓜汁的褐变程度。经HHP处理的香蕉豆浆复合汁，其PPO、POD活性分别在压力为400 MPa、100～400 MPa时显著降低[8]；Ortuño等[9]报道了菲律宾番石榴果泥中的POD经600 MPa/5 min后，其活性下降了78%。桃汁经600 MPa/25 min后，其PPO活性下降了79%[10]。可见不同果汁中的氧化酶对HHP的耐压性不同，但有关HHP对杨梅果汁中氧化酶的影响未见报道。

本文主要研究了HHP压力与保压时间，以及持续保压对杨梅果汁中PPO与POD钝化的影响。对比传统高温灭酶，拟合建立HHP压力与酶活性的一级动力学回归方程，得到PE，ND、Dp及K等关键性指标，为杨梅果汁中氧化酶的钝化起指导预测作用，以期为HHP加工果汁、延长果汁保质期提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

新鲜杨梅（原产地：中国仙居）。

PPO活性检测试剂盒（BC0190）、POD活性检测试剂盒（BC0095），中国北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

CQC2-600型全液相超高静压食品灭菌机，北京速原中天公司；HR2874榨汁机，荷兰飞利浦公司；14886真空包装机，浙江宁波得力有限公司；YC-520L医用冷藏箱，中科美菱低温科技股份有限公司；Centrifuge5810R离心机，德国Eppendorf公司。

1.3 实验方法

1.3.1 杨梅汁制备

杨梅清洗后浸泡于冰水浴中，去核，用榨汁机挤压得到粗杨梅汁；然后用冷冻高速离心机于8000 r/min离心10 min（4 ℃），取上清液，得到澄清杨梅汁（鲜榨杨梅汁）。

1.3.2 HHP及高温处理

因考虑压力的上升会带来温度的增加（压力每上升100 MPa，样品和加压介质温度上升3 ℃）[11,12]，分别用300、450、600 MPa压力处理杨梅果汁0、5、10、15、25、30 min，并对600 MPa/30 min处理组，进行2～3次重复加压（即2～3次600 MPa/30 min处理）。另取一组高温灭菌（100 ℃，15 min）。每个实验均重复三次，处理完成后将所有样品于4 ℃冷藏储存。

1.3.3 酶活性测定

PPO活性和POD活性测定按各自检测试剂盒说明使用方法操作。

吸取0.005 mL鲜榨杨梅汁或高温、HHP处理的杨梅果汁，加入1 mL试剂盒内的酶提取液进行冰浴匀浆；8000×g 4 ℃离心10 min，取上清，置冰上待测。分别调节分光光度计波长至410 nm、酶标仪波长至470 nm处测定PPO、POD样品的吸光度，通过计算得到酶活性A（U/mL)：

式中：

A——t（min）时间HHP处理后剩余酶活性，U/mL；

ΔABS——吸光度变化值。

文中出现的酶活性（%）计算公式如下：

式中：

A0——酶的初始活性，U/mL。

1.3.4 数据的实验设计和统计分析

以压力水平（300～600 MPa）和保压时间（0～30 min）为自变量，运用IBM SPSS Statistics 25进行数据分析，评价压力和时间及其交互作用对酶活性的影响。采用广义线性方法（generalized linear model，GLM）对结果进行方差分析，通过邓肯多重比较各因素水平之间的显著性差异。酶活性（因变量）与自变量水平（压力、时间）的相关性由公式（4）定义为：

式中：

Xijk——各种因素的共同影响；

μ——各种处理的观测结果；

əj——第一个影响因素；

ək——第二个影响因素；

əjk——相互影响因素；

εijk——实验误差分析。

1.3.5 动力学数据分析

将酶的压力失活分为两种影响效应，一是加压与降压引起的活性变化（相当于压力脉冲效应），二是在保压时间内压力对酶活性的一级动力学分析。在保压时间内，酶的压力失活是以一级速率动力学为基础的，如公式（5）：

式中：

K——反应速率常数，min-1。

在给定压力下，导致酶初始活性下降90%的保压时间，即酶活性减少一个对数值所花的时间称之为D值，D值可从log（A/A0）与时间的对应关系中得到，如公式（6）。

根据Riahi等[11]定义，压力脉冲为保压时间为0 min的压力处理技术，即样品被加压到指定压力后立即减压的过程。PE为初始活性减去经过脉冲后的活性（对数标度）得到[11,13]，如公式7。ND表示酶活性降低一个对数所需要的压力脉冲数[14]，如公式（8）。

Dp值为时间等效值，定义为在给定的压力下脉冲一次等同于在这个压力下保持时间的效果，即一个压力脉冲实现的等效破坏。由于D值为在给定压力下与其保压时间的关系，所以Dp值可以由PE而导致的酶活性对数减少获得[11]，如公式（9）：

2 结果与讨论

2.1 HHP压力和时间对PPO和POD活性的影响

鲜榨杨梅果汁中PPO初始活性为17.14 U/mL，POD为48.10 U/mL。HHP处理对PPO和POD的酶活性影响如图1a、1b所示。随着压力升高、时间延长，酶活性均会有不同程度的下降。压力大小、保压时间及其相互作用对酶活性的影响是极其显著的（p＜0.001)。同时，不同压力水平下酶活性水平平均值均有显著性差异，且不受保压时间的影响。对比POD，HHP对钝化PPO的效果更好。300 MPa/0 min处理的PPO和POD的钝酶效果最差，PPO甚至出现了激活现象，其酶活性为鲜榨的105%；而在600 MPa、保压时间大于20 min时，PPO灭酶率达到90%以上，POD达到80%以上。在600 MPa处理时，保压时间的延长对酶活性下降影响很小（均下降不到5%）。将杨梅汁在600 MPa/30 min HHP重复2～3次处理，同时对比高温灭菌（100 ℃，15 min）处理组，PPO和POD活性变化分别见图1c、1d。高温灭菌后，两种酶都完全被灭活，HHP处理中，酶未被完全灭活，且随着HHP处理次数的增加，其活性变化小于1%，钝化效果不明显。

改变酶活性的方式主要分为两种。一种是对酶（主要成分为蛋白质）二、三级构象的改变，另一种是改变酶的修饰位点。酶的三级结构由疏水键和离子相互作用力（静电相互作用力和范德华作用力）维持，二级结构主要由氢键链接，从而保持酶结构的稳定。酶在HHP下会出现类似于高温处理下结构的变化[15]，压力通过破坏酶蛋白的离子相互作用力和各种非共价键（疏水键、氢键）来钝化酶的活性[16]。这些作用力和分子运动的减弱会进一步导致酶蛋白二三级结构的展开，而形成酶活性中心的氨基酸残基仅在分子的天然结构中发生作用，因此折叠结构的展开将会导致酶部分结构解体，从而导致酶活性的丧失[17,18]。在低压下，根据Balny等[19]和Cheftel[20]的研究，压力不足以使蛋白酶三级结构完全展开，而通过改变部分空间结构位置从而暴露出酶的部分修饰位点，最终增加酶活性。因此，杨梅汁中PPO的部分修饰位点在300 MPa处理后暴露出来，增加了其活性；而在高压400 MPa以上，PPO和POD的空间结构发生改变，从而使酶钝化。但酶活性变化还受水果种类影响。Riahi等[11]报道了苹果汁在400 MPa水平下，PPO活性降低了0.12个对数周期。而葡萄汁在经400 MPa/15 min处理后，PPO得到了激活[21]。POD相对耐压性较强，苹果和辣根中的POD已被证明在极端HHP下仍具有较高的抗压能力，即使在压力高达1000 MPa的情况下，也未能被完全灭活，且在保压时间15～30 min内时，钝化效果并不明显[22]。

2.2 酶的钝化动力学分析

2.2.1 PPO和POD的动力学拟合

如表1所示，对PPO和POD活性进行一级动力学拟合，得到一级线性回归方程。各个压力水平下R2值均大于0.8，说明模型与实际拟合较好，线性回归方程可以较好地拟合杨梅汁中保压时间分别和PPO、POD活性之间的关系；皮尔逊相关系数为负值，表明酶活性随着保压时间的增加而减少，同时其绝对值均大于0.9，进一步表明了保压时间与酶活性具有显著相关性。因此，线性回归方程对杨梅汁中PPO和POD活性与HHP条件处理条件的拟合结果是可靠的。

表1 不同压力水平下PPO和POD活性的动力学拟合Table 1 PPO and POD activity fitting results under different pressure levels

2.2.2 PPO和POD的动力学参数分析

进一步利用ND和DP等值表明压力脉冲次数、保压时间与酶活性的关系（表2）。PE则表示酶活性每降低一个对数所需要在该压力条件下施加的脉冲次数的倒数。例如，PE为0.2时表示在五个压力脉冲下酶活性降低一个对数；对应于相应的ND值，即酶活性降低一个对数所需要的压力脉冲数为5。

表2 NFC杨梅汁中PPO和POD的PE、失活率、ND、D、K、DP值Table 2 PE, percentage of inactivation, ND, D, K, DP of PPO and POD in NFC bayberry juice

因此，对于PPO，在400 MPa时，约3次压力脉冲才能使PPO活性下降一个对数；而在600 MPa时，ND值为1.04，表示约一个压力脉冲即可使酶活性降低一个对数。但在300 MPa时，ND值却为负值，这是由于PPO为蛋白质类内源酶，在较低压力下，其三级结构被破坏，部分活性修饰位点暴露，酶被激活。对于PPO，K值随着压力的增大而增大，表明压力越高，该压力下压力保持时间对杨梅汁中PPO所产生的钝化效果越强，推测有可能是在较低压力下，酶的三级结构未被完全破坏，在保压过程中，所施加的压力影响也不足以使其结构得到完全不可逆破坏，而较高压力下PPO的二、三级结构在保压过程中出现持续性不可逆失活，破坏氢键和分子间相互作用力，从而对酶活性产生较强的抑制效果。

对于POD，在600 MPa时，ND值为1.59，表明单独施加一次高压脉冲并不能达到钝化POD 90%酶活性的效果。此外，两种酶的K值都逐渐增大，而POD的K值所增加的速度远低于PPO，这也表明POD活性受压力影响比PPO弱，体现了POD更好的耐压性。同时，两种酶在600 MPa时Dp值都为19，表明在该压力下，保压19 min对酶产生的影响都相当于施加一次高压脉冲所产生的效果。这与一些研究结果相似，如在对HHP处理黑果枸杞汁影响的研究中，300 MPa以上HHP处理能有效钝化POD酶，其酶活降为鲜榨的50%。对于PPO酶，300 MPa未能显著降低其酶活性，400 MPa以上压力则有较好的钝化效果，使PPO活性降低到0.5 U/mL以下[23]。

3 结论

3.1 杨梅果汁经过HHP处理后，随着压力升高、时间延长，酶活性产生不同程度的下降，300 MPa/0 min条件下HHP处理的钝酶效果最差。HHP的压力大小和保压时间及其相互作用对PPO和POD活性的影响均有极高的显著性（p＜0.001）。但600 MPa/30 min条件下，加压次数的增加不能明显加强钝化效果。

3.2 PPO在300 MPa处理下PE值为-0.02，出现酶激活现象，说明在低压条件下，压力效应有可能使PPO更多的酶促位点得到暴露，从而增强了酶活性。在较高压力（400～600 MPa）处理下，PPO活性受到了不同程度的钝化，在600 MPa/10 min即可达到钝化90%酶活性的效果。在300～600 MPa之间，随压力增大，K值从3.03×10-2到12.12×10-2依次递增，表明压力越高，该压力下压力保持时间对杨梅汁中PPO所产生的钝化效果越强。在600 MPa下ND值为1.04，表明在实际生产中，施加一次高压脉冲即可钝化近90%；Dp值为19表明在该压力下，保压19 min对酶产生的影响相当于施加一次高压脉冲所产生的效果。

3.3 POD在300～600 MPa压力处理下均显示出不同程度的钝化效果，但与PPO相比，POD表现出了较高的耐压性，在500 MPa下仅能钝化50%左右活性，即使在600 MPa下加压30 min、重复多次的情况下，都未能达到钝化90%酶活性的效果。在300～600 MPa之间，随着压力的增大。K值从1.23×10-3依次增加到7.67×10-3，但斜率小于PPO，表明POD的耐压性要高于PPO。在600 MPa下ND值为1.56，表明单独施加一次高压脉冲并不能达到钝化POD 90%酶活性的效果；Dp值也为19，表现出了与PPO相类似的规律。这些参数对NFC杨梅果汁中氧化酶的钝化起到了一定指导预测作用，同时在实际生产中能够进一步满足企业需求、节省生产时间。