光交联粘弹性水凝胶快速恢复损伤膝关节运动的实验研究

张周阳 刘富伟 辛河 贾雪连 宁小娜 张羽博翰 郭维维 张于凡 李云鹏 孔亮

高强度、频繁的关节活动常导致关节疲劳，造成关 节损伤，其发生率在军事训练中可高达26.4%～35%，在运动员中高达 11%［1－2］。而异常咬合关系、习惯等带来的不良应力也常造成颞下颌关节损伤及相关疾病［3］。随着材料科学与组织工程技术的不断发展，水凝胶材料可降解性、药物控释、可控固化等多样性能，可用于实现关节损伤的再生修复［4］。然而关节组织再生重建缓慢，且具有粘弹性，而非单纯弹性形变的独特承力特点，导致现有水凝胶材料本身或其在机体内改建过程中难以承担生理运动载荷，是制约水凝胶材料临床应用的关键问题［5］。由此，本研究将以明胶、透明质酸这两种临床经典材料为基材，在保有水凝胶再生修复与可控固化优势前提下，探索赋予材料粘弹性承力特点是否可以快速恢复损伤关节运动，为相关生物材料设计与疾病治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性SD大鼠，体重约250 g（第四军医大学动物实验中心），SPF级饲养，自由进食水，12 h昼夜周期节律。实验前进行跑动适应性训练，放入滚轮内，维持转速0.12 m／s，每天分上下午训练15 min／次，连续5 d后将跑动能力强的8周龄大鼠挑出20只，进行分组和模型制备。

1.1.2 主要试剂与仪器 明胶、甲基丙烯酸酐、光引发剂、透明质酸（上海国药）；场发射扫描电镜（Hitachi，日本）；小动物跑轮系统（第四军医大学第一附属医院骨科）；应变仪与粘度检测器（西北工业大学理学院）。

1.2 方法

1.2.1 该新型光交联粘弹性水凝胶（新型水凝胶）构建 将明胶透析纯化后加入甲基丙烯酸酐，混合均匀后发生加成反应，随后加入透明质酸钠粉末并混入光引发剂以形成交联网络，此时在常温下保持为液态水凝胶。在波长365 nm紫外光（UV）照射2 min后即可固化。

1.2.2 结构表征 光交联固化后冰冻干燥1 d，抽真空、表面喷金后用扫描电镜观察其表面。

1.2.3 粘弹性表征 实验组：新型水凝胶（具有明胶硬链网架结构与透明质酸软链填充）；阴性对照组：单纯明胶支架（仅有明胶硬链，但网架结构相似）。分别使用应变仪进行弹性模量检测，使用粘度检测器进行粘度检测，以分析新型水凝胶粘弹性特点。

1.2.4 大鼠关节损伤模型构建 实验组与阴性对照组同上，增加空白对照组（造模但不修复）、商业对照组（临床用于缓解关节损伤症状的经典透明质酸注射剂，间隔1周注射）。采用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（0.167 mL／100 g体重），碧蓝麻（单侧关节 0.1 mL）关节腔注射局部麻醉。为避免健肢代偿性运动，采取双侧膝关节造模，进行同分组处理。膝关节周围脱毛，常规消毒后铺巾。于膝关节外侧切开皮肤并由外向内脱臼髌骨，此时于关节正中切开关节囊，可充分暴露关节软骨、半月板等结构。在股骨滑车处，用直径3 mm的环钻垂直钻孔深度2 mm，保证足量、持续生理盐水冲洗降温，随后离断并摘除半月板。注入液态材料后用365 nm波长紫外光照射2 min，确保损伤修复平整处无活动性出血。而后依次缝合关节囊、皮肤，常规饲养。各组于术后1周进行行为学检测，2月后取材进行组织学检测。

1.2.5 滚轮运动测试术后1周，待切口愈合后，将各分组大鼠置放于小动物跑轮系统内，设置转速0.12 m／s后，于前方30 cm处放置相机进行拍摄，观测并记录大鼠出现抗拒跑动行为的时间，间隔4 h后重复观测，反复3遍。

1.3 组织学检测

术后2月取材，取材后用PBS冲洗组织，置于40 g／L多聚甲醛固定36 h备用。采用EDTA脱钙液常规脱钙4周，石蜡包埋后沿股骨滑车前后方向连续切片，厚度4μm，常规HE、番红O染色，显微镜观察。

1.4 统计学分析

数据结果使用Origin 2021统计软件进行分析、作图，组间差异比较使用单因素方差分析，检验水准α＝0.05，以 P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 新型水凝胶材料性能表征

常温下该新型水凝胶成液体，具有流动性，材料表面与水平面平行（图1A），筛选固化参数后，最终确定2 min为单次固化标准时间，此时有效固化深度约为3 mm。在365 nm波长UV照射后，材料表面与容器底部平行（图1B）。扫描电镜可见该水凝胶固化后呈现网状、均匀、多孔样结构，孔内均匀填塞透明质酸（图1C）。同时，分别对实验组和阴性对照组进行粘弹性承力检测后发现，无论代表材料弹性的储能模量（图1D），还是代表材料粘性的损耗模量（图 1E），实验组均高于阴性对照组，表明实验组材料具有粘弹性力学特点。最后，进行材料粘度检测，以比较材料抗剪切力的性能，发现实验组的粘度高于对照组（图1F）。

图1 光交联粘弹性水凝胶材料性能表征Fig 1 Characterization of photocross-linked viscoelastic hydrogel

2.2 新型水凝胶对动物损伤关节运动的恢复效果

造模术如图 2所示。术后动物无感染、无死亡。术后1周进行行为学检测，2月进行组织学检测。

图2 大鼠关节损伤模型建立Fig 2 Establishment of joint injury model in rats

录像数据分析显示，空白组大鼠率先停止了跑动，紧扒在滚轮上（图3），随后是阴性对照组与商业对照组，姿态从跑动变化为跳动，随后停下，也紧扒在滚轮上（图3）。实验组在持续运动20min后依然能维持跑动姿态，并且在重复3次后均出现同样的表现（图3）。进行数据统计后，实验组的单次极限运动时间远超过其他对照组（图3）。

图3 大鼠运动能力检测Fig 3 Comparison of motor ability of rats

2.3 新型水凝胶在体转归效果

见图4。HE与番红O染色观察发现，空白组关节缺损严重，出现断崖式凹坑，关节软骨、软骨下骨结构破坏，缺损区内无软骨细胞，而被纤维组织覆盖；阴性对照组也出现断崖式凹坑，但存在部分结构不良的软骨组织；商业对照组具有一定的关节修复效果，表面具有一定厚度的软骨层，依旧软骨下骨结构不良，整体缺损仍呈凹坑状；实验组动物关节面平整，关节软骨厚度恢复较好，其中分布大量软骨细胞，组织结构边界清晰，基本实现关节损伤区的再生与改建。

图4 缺损区组织学染色观察 （×250）Fig 4 The histological observation of the defect area （×250）

3 讨 论

关节的承力功能和组织结构，与所受力学载荷大小、周期、角度等参数息息相关［6］。在军事活动中，空降兵在跳伞落地时，关节常受到地面的直接冲击或与装备发生撞击，其中颞下颌关节损伤及膝关节软骨缺损是较严重表现。更有文献指出，在某部伤残军人中，骨与关节损伤占比高达70.61%，严重影响我军战斗力［7］。

恢复损伤关节运动是临床治疗核心。关节腔内注射透明质酸是缓解关节损伤症状的经典方案。然而症状虽缓解但损伤依旧会不断加重［8］。自体软骨是修复材料中的金标准，但来源局限、适应症窄，临床应用局限［9］。异体或异种软骨目前仍未能根本上解决存储、脱敏等核心工艺，应用较少［10－11］。近年来学者们开发多种新型材料以期实现损伤关节的再生修复，形成类天然组织，以恢复生理运动状态［12］。然而目前相关研究主要集中于提升材料生物活性，对生理运动中的力学性能却关注不足［13］。这导致大量生物材料缺乏生物力学设计，材料本身或修复改建过程中难以承担生理运动载荷［14］。近年来有学者提出，关节尤其是表面软骨组织具有粘弹性承力特性，而非传统理解上的单纯弹性形变，赋予材料适当粘弹性将进一步促进组织再生［15］。

由此，本实验构建了一种新型水凝胶，在保有水凝胶材料再生修复与可控固化优势条件下，进一步赋予材料粘弹性承力特点。实验证实该新型水凝胶可快速恢复大鼠损伤关节运动功能，使术后初始运动时间由6周后可做简单活动，提升到1周可跑动，效果远超非粘弹性材料与现有临床使用的透明质酸注射治疗。该新型材料的构建方法一定程度上模拟了天然软骨中II型胶原与蛋白聚糖间的作用关系。同时，本研究也希望利用两种材料体内代谢速度差异，维持修复区域力学性能稳定。最后，由于关节损伤个体差异大，本研究借鉴光固化树脂修复牙齿缺损思路，使其经2 min照射即可具有稳定结构，并可满足分层固化要求，未来有望在关节镜等技术辅助下实现相关疾病的微创治疗。以上设计理念及实验结果共同表明，力学性能应纳入关节修复材料设计，对快速恢复损伤关节功能意义重大。