鼻咽拭子细菌培养在儿童细菌性呼吸道感染病原诊断中的价值

谢永平， 华春珍， 魏林琳， 汪洪姣， 王高良， 李建平

（1.浙江大学医学院附属儿童医院感染病科，浙江 杭州 310003；2.浙江大学医学院附属儿童医院实验检验中心，浙江 杭州 310003）

呼吸道感染是临床常见的疾病之一，以肺炎为代表的下呼吸道感染是造成儿童门诊和住院的最常见原因[1]。发展中国家儿童肺炎以细菌感染多见，其中肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）、流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）和卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis）是全球公认的社区获得性肺炎三大细菌学病原[1-3]，这些病原菌的确定往往通过气道分泌物——肺泡灌洗液、肺穿刺液、深部痰液培养协助诊断。肺泡灌洗液、肺穿刺液检测为创伤性检查，在儿科临床不常用；采集儿童痰液比较困难[4]，＜1岁的患儿不能自主咳痰，通过诱导收集的痰液样本合格率也较低[5-6]，明显影响肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等呼吸道苛氧菌的检出率[4-6]。此外，百日咳再现是近年来国内外的热点问题[7-8]，百日咳的病原——百日咳鲍德特菌（Bordetella pertussis，BP）是上呼吸道病原，鼻咽拭子是培养百日咳鲍德特菌的最理想样本，而且鼻咽拭子采集很容易规范化操作。本研究通过对类百日咳综合征和急性肺炎患儿同时进行鼻咽拭子培养和深部诱导口腔吸取物培养，比较2种样本细菌培养的阳性率和分离菌种，并结合患儿临床症状和治疗后细菌培养结果，评价鼻咽拭子培养在儿童细菌性呼吸道感染中的诊断价值，为儿童呼吸道样本的采集方式选择提供参考。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2019年1月1日—6月30日浙江大学医学院附属儿童医院某病区疑诊为急性肺炎和类百日咳综合征的患儿。纳入标准：（1）年龄＜1岁；（2）符合肺炎诊断标准[9]；（3）类百日咳综合征患儿具有类似百日咳的临床表现[10]。排除标准：（1）胃食管反流等影响负压抽吸诱导痰液患儿；（2）因出牙影响吸痰患儿；（3）近期有鼻腔出血或其他鼻腔问题影响鼻咽拭子采集患儿。本研究获浙江大学医学院附属儿童医院伦理委员会批准（伦理编号：2016-IRB-014），患儿监护人均知情同意。

1.2 仪器和试剂

英国OXOID 公司CM0119碳琼脂培养基（生产批号1824403）、选择性鲍德特菌培养基添加物（每支含头孢氨苄20.0 mg）；英国Remel Europe公司百日咳鲍德特菌凝集血清（生产批号1508264）和副百日咳鲍德特菌凝集血清（生产批号1751599）；意大利Copan公司无菌藻酸钙鼻咽拭子。法国生物梅里埃公司含5%羊血的哥伦比亚基础琼脂培养皿和嗜血杆菌选择性培养基（HAE）、VITEK 2 Compact自动化鉴定药敏仪。德国Bruker公司Microflex LT/SH质谱仪。

1.3 方法

1.3.1 样本采集 同时采集患儿入院时鼻咽拭子和口腔吸取物样本。鼻咽拭子采集时固定患儿头部及上肢，将拭子贴鼻孔壁，沿垂直于耳垂方向慢慢转动进入患儿1侧鼻孔内，至鼻腭处（深度约为鼻尖至耳垂距离），然后边擦拭边旋转至少3圈，慢慢取出，置于原装无菌套管内立即送检。口腔吸取物采集时患儿行0.9%氯化钠溶液雾化，经口腔负压抽吸深部口腔吸取物至少5 mL，置于无菌痰杯立即送检。合格口腔吸取物的标准为涂片镜检每低倍镜视野白细胞＞25个、上皮细胞＜10个[5]。

1.3.2 样本的接种、培养和鉴定 样本采集后（包括不合格口腔吸取物）立即分区划种于含5%羊血的哥伦比亚基础琼脂培养皿。嗜血杆菌选择性培养皿和碳琼脂培养皿。前两者置5%CO2孵箱，35 ℃（湿度60%～70%）孵育18～20 h；后者置普通孵箱，35 ℃（湿度60%～70%）孵育7 d。

1.3.3 细菌鉴定 流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌的鉴定采用NH卡，肺炎链球菌的鉴定采用GPI卡加Optochin试验。百日咳鲍德特菌的鉴定采用抗血清凝集试验+质谱分析验证。百日咳鲍德特菌只要分离到，无论定量多少，均有临床意义；其他细菌培养结果“+++”及以上考虑有临床意义[11]。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。正态分布计量资料以±s表示，非正态分布资料用中位数（M）[四分位数（P25，P75）]表示。计数资料以例或率表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患儿一般情况

共纳入患儿403例，其中男145例（36.0%），年龄（157±97）d；女258例（64%），年龄（158±88）d。有7例（1.7%）患儿合并基础疾病，其中先天性喉软骨软化3例、癫痫2例、脑萎缩和支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）各1例。有303例（75.2%）患儿入院前经β-内酰胺酶类抗菌药物治疗5（3，10）d，31例（7.7%）单用大环内酯类抗菌药物治疗4（3，5）d，69例（17.1%）入院前未经抗菌药物治疗。按照痰液的标准，403份口腔吸取物样本合格率仅为12.2%（49/403）。

2.2 口腔吸取物和鼻咽拭子培养结果比较

分别有50份（12.4%）口腔吸取物样本和127份（31.5%）鼻咽拭子样本样本分离到致病菌（如百日咳鲍德特菌）或条件致病菌“+++”以上。鼻咽拭子培养总阳性率（χ2=42.92，P＜0.001）和百日咳鲍德特菌（χ2=49.10，P＜0.001）、流感嗜血杆菌（χ2=4.17，P=0.041）、卡他莫拉菌（χ2=7.38，P=0.007）、肺炎链球菌（χ2=4.37，P=0.037）的分离率均显著高于口腔吸取物样本。62.0%（31/50）的患儿鼻咽拭子细菌培养结果与口腔吸取物细菌培养结果一致。2种样本细菌培养结果见表1。

表1 403例患儿2种样本病原培养结果比较

2.3 患儿临床特点和治疗转归

鼻咽拭子培养到条件致病菌的127例患儿中，男性患儿69例（54.3%）、女性患儿58例（45.7%）；百日咳患儿54例（42.5%），其中38例合并肺炎；类百日咳综合征患儿24例（18.9%），其中10例合并肺炎；无百日咳样咳嗽肺炎患儿49例（38.6%），其中2例合并脓毒症、1例合并鹅口疮、1例合并流行性感冒、1例合并血小板减少性紫癜。除5例百日咳患儿症状改善不明显外，其余122例（96.1%）患儿治疗后，均治愈或好转，无并发症和后遗症发生。127例恢复期患儿经鼻咽拭子培养复查，病原阴转率为98.4%（125/127），仅2例百日咳患儿百日咳鲍德特菌持续阳性。

3 讨论

人体鼻咽部是一个含大量正常菌群的巨大微生态系统，这些正常菌群通常包括链球菌属、嗜血杆菌属、葡萄球菌属、莫拉菌属和棒状杆菌属，是人体抵御致病菌、条件致病菌的一道重要的微生物屏障[12-13]。肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌为鼻咽部常见条件致病菌，在鼻咽部少量存在时构成正常菌群的一部分，但当某种细菌呈绝对优势生长时，可引起机体感染。痰液培养在下呼吸道感染病原诊断中的价值一致受到争议[14]。一般认为，上述细菌在痰液等上呼吸道有菌定植或寄生来源的样本分区划种半定量达“+++”及以上时，应考虑感染可能，可界定为阳性[15]。鼻咽部菌群与下呼吸道感染关联，当鼻咽部某些细菌增多，开始优势生长时，就可能向下呼吸道移行，引起肺部感染[16]。本研究403份口腔吸取物样本中仅有12.4%的样本细菌培养结果阳性，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌这三大社区获得性肺炎病原菌分离率较低，除与这些苛养菌体外生存能力较弱、对营养要求较高有关外，还与本研究人群为＜1岁患儿有较大关系，从患儿口腔按照吸痰操作吸出的部分吸取物并非真正的痰液，近90%不符合痰液标准，与相关研究结果[6]一致。本研究发现，鼻咽拭子培养条件致病菌半定量达“+++”及以上的分离率显著高于口腔吸取物培养，尤其是流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和卡他莫拉菌等苛养菌的分离率大幅度提高，且病原菌与临床感染符合，治疗后患儿临床症状改善的同时，这些病原菌在鼻咽部优势生长的状态不复存在，提示鼻咽拭子培养的结果对患儿细菌性下呼吸道感染的病原诊断有参考价值。

百日咳是由百日咳鲍德特菌感染引起的急性呼吸道传染病，近年来在国内外发病率大幅度上升[17-18]，已引起广泛关注。百日咳鲍德特菌是上呼吸道病原，主要感染部位在鼻咽部，很少侵入下呼吸道引起肺炎，因此鼻咽拭子是监测百日咳鲍德特菌的最佳样本。本研究由于入组时纳入较多类百日咳综合征患儿，百日咳鲍德特菌分离率最高，也提示百日咳是儿科临床常见病种[19]。本研究中，口腔吸取物极少培养到百日咳鲍德特菌，符合百日咳的特点。本研究还发现，百日咳患儿合并或继发流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌和肺炎链球菌感染的概率较高，其具体机制有待进一步研究。

采集鼻咽拭子作为病毒检测的样本应用广泛，但关于鼻咽拭子培养在下呼吸道感染患儿病原菌诊断中的价值，国内外鲜有报道。鼻咽拭子样本采集较为简单，操作过程容易规范，包括进入鼻腔的深度和刷取黏液时拭子旋转的次数都可数据化界定，可确保不同人员采集的样本质量都能均质稳定。本研究的不足之处在于研究样本量不够大，且仅仅是单中心研究。为更客观地评价鼻咽拭子培养在儿童呼吸道感染病原诊断中的价值，我们拟建立多中心研究平台，在细菌培养的同时，采用鼻咽拭子高通量测序分析鼻咽部的菌群类型和各优势菌属、菌种的绝对丰度、相对丰度，分析鼻咽拭子分区划种培养半定量结果与高通量测序菌群丰度之间的定量关系，并与临床诊治结果相关联，以更好地评价鼻咽拭子培养在儿童呼吸道感染病原诊断中的价值。