延迟放瓶对2种自动化血培养系统苛养菌培养的影响

褚敏君， 李小娟， 黄海林， 李 珏， 麻明彪， 杜廷义， 王海平

（昆明市儿童医院 昆明医科大学附属儿童医院检验科，云南 昆明 650228）

血流感染（bloodstream infection，BSI）是一种病死率极高的全身感染性疾病[1]，快速、准确地检出血液中的病原菌，可有效降低病死率，提高治愈率。在临床工作中，因各种原因常常不能及时将血培养瓶放入培养系统中，延迟放瓶现象较为普遍。针对延迟放瓶对血培养阳性检出情况的影响，本研究选取肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）和流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）这2种儿童感染常见的苛养菌，制备不同浓度含菌血液模拟样本，比较其室温放置不同时间后，在2种自动化血培养系统中的阳性检出情况。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

标准菌株肺炎链球菌（ATCC 49619）和流感嗜血杆菌（ATCC 9007）购自国家卫生健康委临床检验中心。

1.2 仪器与试剂

BACTEC FX血培养仪及配套中和儿童抗菌药物需氧瓶BactecPeds Plus（美国BD公司）。BACT/ALERT 3D血培养仪及配套儿童中和抗菌药物需氧瓶 BacT/ALERT PF（法国生物梅里埃公司）。无菌血液来自身体健康未使用过抗菌药物的献血者。

1.3 方法

用无菌0.9% NaCl溶液将标准菌株配制成1×102、1×103和1×105CFU/mL的菌悬液备用，通过菌落计数确证菌悬液浓度。在每个血培养瓶中均注入5 mL无菌全血，再加入1 mL配制的菌悬液混匀，每份样本重复配制3瓶。将含不同浓度菌悬液的血培养瓶分别在室温（22 ℃）中放置0、8、16和24 h后，分别放入BACT/ALERT 3D血培养仪和BACTEC FX血培养仪中。培养仪的预设培养时间为5 d，若5 d后系统仍未报阳，则为培养阴性。报阳样本报阳时间为3瓶的平均值。抽取所有培养瓶内液体，转种后进行菌种鉴定，以确认生长菌为接种菌，且未被污染。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0软件进行数据分析。采用重复测量方差分析评价受试者内因素（不同的血培养系统、延迟放瓶时间和菌液浓度）对因变量（细菌报阳时间）的影响。采用Mauchly球对称假设检验分析受试者内因素的交互作用；对不满足球对称假设的数据，采用Greenhouse-Geisser计算球对称系数ε，校正结果。呈正态分布的计量资料以x±s表示，2组之间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析结合Bonferroni校正。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 培养结果

不同浓度肺炎链球菌和流感嗜血杆菌接种瓶经室温放置不同时间后，在2种血培养仪中均自动检出阳性。报阳时间见表1。

表1 不同延迟放瓶时间2种苛养菌不同血培养仪平均报阳时间 h

2.2 不同因素及其交互效应对报阳时间的影响

BACTEC FX血培养系统报阳时间短于BACT/ALERT 3D血培养系统，报阳时间随延迟放瓶时间的增加呈延长趋势，随菌液浓度的增高呈缩短趋势（P＜0.001）。肺炎链球菌延迟放瓶0 h的报阳时间与8、16、24 h比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；流感嗜血杆菌延迟放瓶0 h的报阳时间与8、24 h比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 不同因素及其交互效应对苛养菌报阳时间的影响

3 讨论

作为诊断BSI的金标准，血培养在临床工作中发挥着重要作用。提高血培养阳性检出率、缩短检测时间，一直是临床微生物实验室努力的目标。血培养阳性结果的正确与否受样本、仪器、检测原理等多种因素的影响[2]。BACTEC FX血培养系统和BACT/ALERT 3D血培养系统是目前临床微生物实验室广泛使用的血培养系统，但2个血培养系统对常见病原菌的阳性检出率和报阳时间存在一定的差异[3]。

在实际工作中，由于工作流程和资源投入等多种因素的制约，血培养样本采集后不能及时放入培养仪的情况较为普遍，分析延迟放瓶对血培养阳性检测结果的影响十分重要。孙景勇等[4]发现，延迟放瓶＜16 h，BACT/ALERT 3D血培养系统和BACTEC 9120血培养系统的阳性检出率差异均无统计学意义（P＞0.05）；而延迟放瓶24 h，前者的阳性检出率明显高于后者（P＜0.05）。本研究中，所有样本经室温放置不同时间后，在2种血培养系统中均可检测到阳性结果。产生差异的原因可能与测试菌种不同有关，孙景勇等[4]测试的是大肠埃希菌，其在放置过程中可能会因为产酸量积累的原因，干扰血培养仪的监测过程和结果判断。此外，本研究使用的BACTEC FX血培养系统与BACTEC 9120血培养系统在检测原理上的差别也可能是阳性检出率出现差异的原因。

肺炎链球菌和流感嗜血杆菌作为临床常见苛养菌，是我国儿童临床分离优势株，分离率明显高于成人[5]，在昆明医科大学附属儿童医院BSI病原中所占比例呈逐年上升趋势[6]。本研究中，2种苛养菌在BACTEC FX血培养系统中的报阳时间均短于BACT/ALERT 3D血培养系统（P＜0.001），与相关报道结果[7-8]一致。肺炎链球菌经室温延迟放置8、16和24 h后，报阳时间均显著长于0 h放置样本。有研究结果表明，肺炎链球菌可在血培养阳性报警后8～10 h内自溶死亡[9]，延迟培养样本报阳时间延长可能也与此相关，因此临床怀疑肺炎链球菌BSI时，应立即送检。而流感嗜血杆菌经室温延迟放置0和8 h，报阳时间差异无统计学意义（P＞0.05），室温放置8 h不影响其在2种血培养系统中的报阳时间，提示延迟放瓶对不同菌种的阳性检出影响不同。

本研究还发现，菌液浓度、延迟放瓶、血培养系统3个因素之间有相互作用，共同影响血培养检测结果。肺炎链球菌延迟放瓶时，报阳时间受另外2个因素的共同影响 ，BACTEC FX血培养系统检测低浓度肺炎链球菌样本时，报阳时间受延迟放瓶影响，而高浓度样本的报阳时间受延迟放瓶的影响不明显。流感嗜血杆菌血培养系统和菌液浓度会相互影响，在低浓度条件下，BACTEC FX血培养系统报阳时间短于BACT/ALERT 3D血培养系统，而高浓度条件下，差异不明显。

综上所述，随着延迟放瓶时间的延长，2种苛养菌报阳时间均呈延长趋势，BACTEC FX血培养系统在报阳时间上相较于BACT/ALERT 3D血培养系统具有一定优势。这一趋势受多因素作用，不同菌种、菌液浓度及血培养系统均会影响延迟送检时细菌的阳性检出情况。本研究仅对儿童瓶及2种常见苛养菌进行了初步评估，具有一定的局限性。各临床微生物室应根据自身实际情况，有针对性地进行血培养影响因素的评估和控制，建议评估并逐步完善对阴性培养瓶的盲转培养，以最大限度避免因受延迟放瓶影响而造成的漏检。