CircSMARCA5通过miR-4295/PTEN轴调控糖酵解抑制胃癌细胞增殖和侵袭

蔡 娟，陈志强，左学良

1.皖南医学院第一附属医院（弋矶山医院）肿瘤内科，重大疾病非编码RNA转化研究安徽普通高校重点实验室，安徽 芜湖 241001；2.南京医科大学第一附属医院肝胆中心，江苏 南京 210029；3.皖南医学院第一附属医院（弋矶山医院）胃肠外科，安徽 芜湖 241001

胃癌是全世界发病率第五位、死亡率第四位的恶性肿瘤，每年新发病例数近109万，死亡病例数约77万［1］。复发和转移是胃癌患者的首要死亡原因，然而目前对此仍缺乏有效的治疗手段。因此，探索胃癌复发转移机制、寻找有效治疗靶点对改善患者预后具有重要意义。

环状RNA（circular RNA，circRNA）广泛存在于真核生物中，具有高度稳定性、组织特异性和进化保守性等特征，能在多层面调控机体的生理和病理过程［2］，且circRNA与多种肿瘤的增殖、侵袭相关。高表达的circ-RanGAP1 通过负调控miR-877-3p，促进胃癌细胞增殖和侵袭［3］。CircTLK1能结合miR-136-5p，促进结肠癌细胞的增殖和侵袭［4］。

在前期研究中，作者发现circSMARCA5在胃癌组织中呈低表达，与胃癌患者的TNM分期、神经脉管侵犯和淋巴结转移具有显著负相关性，过表达circSMARCA5能抑制胃癌细胞增殖和侵袭［5］，但其具体分子机制仍不清楚。本文通过研究circSMARCA5对胃癌细胞糖代谢重编程的影响，探讨其潜在的分子机制，以期为胃癌提供新的治疗靶点。

1 材料和方法

1.1 细胞培养与实验试剂

人正常胃黏膜上皮细胞系GES-1及人胃癌细胞系MKN45、MKN74、AGS购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。RPMI-1640培养基、10%胎牛血清、胰蛋白酶、青-链霉素和磷酸盐缓冲生理盐水（phosphate-buffered saline，PBS）均购自美国Gibco公司，LipofectamineTM3000和TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒和实时荧光定量聚合酶链式反应（realtime fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）试剂盒购自日本TaKaRa公司，慢病毒circSMARCA5过表达载体（LVcircSMARCA5）和慢病毒阴性对照（LV-NC）购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司，miR-4295模拟物（miR-4295 mimics）和miR-4295模拟物阴性对照（miR-4295 NC）购自广州锐博生物技术有限公司，细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）试剂购自日本同仁化学研究所，transwell小室购自美国BD公司，Seahorse XF糖酵解压力测试试剂盒购自美国Agilent Technologies公司，GLUT1、LDHA和Ki-67抗体、葡萄糖摄取试剂盒和乳酸检测试剂盒均购自英国Abcam公司，PTEN、β-tubulin抗体和辣根过氧化物酶偶联二抗购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 临床标本和实验动物

收集2016年1月—2016年12月于皖南医学院第一附属医院行手术切除的60例胃癌患者的癌组织及癌旁黏膜组织（距肿瘤＞5 cm），其中男性44例，女性16例，年龄36 ～ 78岁。所有患者术前均未接受化疗、放疗或免疫治疗。本研究经皖南医学院第一附属医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。BALB/c裸小鼠8只，雄性，5 ～ 6周龄，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场。动物许可证号：SCXK（苏）2017-0001。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养与转染

利用含10%胎牛血清、青-链霉素的RPMI-1640培养基，将细胞置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养。待细胞贴壁生长融合度达80%时，加入胰蛋白酶消化并传代。取对数生长期的AGS细胞，消化后接种于6孔板中培养过夜，加入过表达circSMARCA5慢病毒载体（LVcircSMARCA5）及其对照病毒（LV-NC）转染细胞，并用嘌呤霉素筛选1周，构建稳定转染细胞株。通过RTFQ-PCR检测circSMARCA5表达水平。在过表达circSMARCA5的稳定转染细胞株中，利用LipofectamineTM3000转染miR-4295 mimics或si-PTEN，48 h后检测miR-4295和PTEN的表达水平。

1.3.2 RTFQ-PCR检测

利用TRIzol 试剂提取组织和细胞总RNA，应用反转录试剂盒将RNA 反转录成cDNA。以cDNA 为模板，按照RTFQ-PCR 试剂盒说明书进行PCR 反应，利用2-ΔΔCt法计算circSMARCA5、GLUT1、LDHA、miR-4295 和PTEN 的相对表达量。CircSMARCA5、miR-4295、GLUT1、LDHA、PTEN、β-actin和U6 的引物序列由广州锐博生物技术有限公司设计并合成。circSMARCA5 有义链为5′-CTCCAAGATGGGCGAAAG-3′，反义链为5′-TGTGTTGCTCCATGTCTAATCA-3′ ；miR-4295 有义链为5′-GGAAGATCTAGGATCACA GTTAACTCAGAA-3′，反义链为5′-CGGGGTA CCGCACAATCCAAAACAAGAA-3′ ；GLUT1 有义链为5′-GGCCAAGAGTGTGCTAAA GA A-3′，反义链为5′-ACAGCGTTGATGCCAG ACA G-3′；LDHA 有义链为5′-ATGGCAAC TCTAAAG GATCAGC-3′，反义链为5′-CCAA CCCCAACAAC TGTAATCT-3′；PTEN有义链为5′-GAGGGATAAA ACACCATG-3′，反向引物序列为5′-AGGGGTAG GATGTGAACCAGTA-3′；β-actin 有义链为5′-TG ACGTGGACATCC GCAAAG-3′，反向引物序列为5′-CTGGAA GGTGGACAGCGAGG-3′；U6 有义链为5′-TGGACTCTGTTCGCTCAGGT-3′，反义链为5′-TGCCTCCTTCCGTACCACAT-3′。

1.3.3 CCK-8实验

将处于对数生长期的细胞按照1×103个/孔的密度接种于96孔板，加入100 μL培养基分别培养24、48、72及96 h后加入10 μL CCK-8试剂，置于细胞培养箱中避光温育2 h，检测450 nm波长处各孔的吸光度。实验重复3次。

1.3.4 Transwell实验

胰酶消化LV-NC和LV-circSMARCA5两组细胞后，用无血清培养基制备2×105个/mL的单细胞悬液，取250 μL细胞悬液加入预铺基质胶的transwell上室，在下室加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，培养24 h后，用4%多聚甲醇固定20 min，1%结晶紫染色10 min，在显微镜下观察并拍照。实验重复3次。

1.3.5 细胞糖酵解能力检测

取处于对数生长期的各组细胞，以2×105个细胞/mL的密度接种于Seahorse 96孔板，待细胞融合度达约80%，通过设定程序加入葡萄糖（10 mmol/L）、寡霉素（1 μmol/L）和2-脱氧葡萄糖（50 mmol/L），利用Seahorse XF细胞能量代谢分析仪检测细胞外酸化速率，并计算糖酵解速率及糖酵解能力值。取2 μL细胞培养上清液，依据葡萄糖和乳酸检测试剂盒说明书，利用GENios Plus酶标仪检测各组细胞葡萄糖摄取水平和乳酸生成量。实验重复3次。

1.3.6 蛋白质印迹法（Western blot）检测

收集各组细胞，提取总蛋白，用二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒测定蛋白浓度，取50 μg蛋白进行10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将分离的蛋白电转移至聚偏二氟乙烯膜上。用5%脱脂奶粉封闭2 h，采用吐温-20三羟甲基氨基甲烷缓冲生理盐水（trisbuffered saline Tween，TBST）洗膜3次，每次10 min，加入稀释的GLUT1、LDHA、PTEN或β-tubulin一抗，4 ℃温育过夜。TBST洗膜3次，加入辣根过氧化物酶偶联二抗，室温温育2 h，TBST洗膜3次，用ECL化学发光试剂显色。

1.3.7 裸小鼠皮下移植瘤实验

将BACB/c裸小鼠随机分为LV-NC和LVcircSMARCA5两组，每组4只。用胰酶消化过表达circSMARCA5的AGS细胞及其对照细胞，加入无血清RPMI-1640培养基调整细胞密度至1×108/ mL，用1 mL注射器向每只裸小鼠肩胛部皮下注射100 μL细胞悬液。从第6天开始，每3天测量肿瘤长、短径，待最大体积达约1 000 mm3时，处死小鼠，取出肿瘤测量并称重，计算肿瘤体积，绘制移植瘤生长曲线。肿瘤体积按照如下公式计算：体积（mm3）=0.5×长径（mm）×短径2（mm2）。

1.3.8 免疫组织化学方法检测

收集各组皮下瘤的组织标本，常规用4%甲醛溶液固定，经脱水、浸蜡包埋、切片后使用山羊血清温育30 min封闭，4 ℃温育一抗过夜。次日用PBS清洗3次，室温温育二抗30 min，PBS清洗3次。滴加辣根过氧化物酶溶液，室温温育30 min，PBS清洗3次，滴加DAB显色液，当显微镜下可见染色区域发黄即可使用蒸馏水冲洗，苏木精复染 1 min。使用梯度乙醇进行脱水处理，二甲苯浸泡，最后滴加中性树胶，盖玻片封片，显微镜下观察并拍照。通过染色强度和阳性细胞比例进行免疫组织化学评分。染色强度评分标准为0分（阴性）、1分（弱阳性）、2分（中等强度）、3分（强阳性）。阳性细胞比例的评分标准为0分（＜10%）、1分（10% ～ 49%）、2分（50% ～ 69%）、3分（＞70%）。将染色强度评分与阳性细胞比例评分相乘计算总分。

1.3.9 双荧光素酶报告基因实验

将野生型或突变型circSMARCA5和PTEN 3′-UTR序列连接到双荧光酶报告载体中，将各野生型或突变型载体分别与miR-NC、miR-4295 mimics共转染。48 h后用双荧光素酶报告基因测定系统检测各组细胞的荧光素酶活性。

1.3.10 RNA免疫沉淀（RNA immunoprecip-itation，RIP）实验

按照RIP试剂盒操作步骤验证circSMARCA5与miR-4295的靶向关系。裂解细胞后，收集裂解液进行实验，利用RTFQ-PCR检测circSMARCA5的富集程度。

1.3.11 统计学处理

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量资料以x±s表示，正态分布的两组计量资料比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，相关性分析采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 过表达circSMARCA5能够抑制胃癌细胞的增殖和侵袭

RTFQ-PCR结果显示，circSMARCA5在胃癌细胞系中表达较正常胃黏膜上皮细胞明显降低（图1A）。LV-circSMARCA5组AGS细胞中circSMARCA5的表达水平较LV-NC组明显升高，表明过表达circSMARCA5的稳定转染细胞株构建成功（图1B）。CCK-8实验和transwell实验结果表明，LV-circSMARCA5组细胞的增殖和侵袭能力较LV-NC组降低（均P＜0.05，图1C和D）。以上结果表明，过表达circSMARCA5能够抑制胃癌细胞的增殖和侵袭。

图1 过表达circSMARCA5能够抑制胃癌细胞的增殖和侵袭Fig.1 CircSMARCA5 overexpression suppresses the proliferation and invasion of gastric cancer cells

2.2 过表达circSMARCA5能够抑制胃癌细胞糖酵解

代谢异常是肿瘤细胞的基本特征之一，circRNA已被证实能够调控肿瘤细胞糖代谢重编程［6］。为了探索circSMARCA5是否参与调控胃癌细胞糖酵解过程，本研究采用RTFQ-PCR检测葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1）和乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase，LDHA）的表达情况，发现过表达circSMARCA5后GLUT1和LDHA的基因表达下降（图2A）。Western blot检测结果进一步证实过表达circSMARCA5可降低GLUT1和LDHA的蛋白水平（图2B）。相较于LV-NC组，LVcircSMARCA5组细胞的葡萄糖摄取水平和乳酸生成量显著下降，差异有统计学意义（图2C）。Seahorse XF细胞能量代谢分析结果显示，与对照组相比，LV-circSMARCA5组细胞外酸化速率降低，表明过表达circSMARCA5可抑制细胞糖酵解活性（图2D）。LV-circSMARCA5组的细胞糖酵解速率及糖酵解能力值低于LV-NC组（均P＜0.05，图2E）。以上结果表明，过表达circSMARCA5能够抑制胃癌细胞糖酵解。

图2 过表达circSMARCA5能够抑制胃癌细胞糖酵解Fig.2 CircSMARCA5 overexpression inhibits glycolysis of the gastric cancer cells

2.3 过表达circSMARCA5能够抑制裸小鼠皮下移植瘤生长

裸小鼠皮下移植瘤实验结果表明，LVcircSMARCA5组的裸小鼠皮下移植瘤体积和重量显著低于LV-NC组，差异有统计学意义（P＜0.001，图3A ～ C）。免疫组织化学检测结果显示，LV-circSMARCA5组皮下瘤组织的GLUT1、LDHA和Ki-67表达显著低于LV-NC组（均P＜0.05，图3D）。以上结果表明，过表达circSMARCA5能够抑制裸小鼠皮下移植瘤生长。

图3 过表达circSMARCA5能够抑制裸小鼠皮下移植瘤生长Fig.3 CircSMARCA5 overexpression suppresses xenograft tumor growth in vivo

2.4 CircSMARCA5靶向调控miR-4295表达

ENCORI 数据库预测结果提示，circSMARCA5与miR-4295存在互补结合的核苷酸序列（图4 A）。据此，我们设计了circSMARCA5与miR-4295结合位点的突变序列，并进行双荧光素酶报告基因实验。结果显示，miR-4295 mimics+circSMARCA5-WT共转染组的荧光素酶活性显著降低（P＜0.001），而miR-4295 NC+circSMARCA5-MUT组和miR-4295 mimics+circSMARCA5-MUT组的荧光素酶活性无明显改变（P＞0.05，图4B）。收集60例胃癌患者癌及癌旁正常胃黏膜组织，患者的临床病理学资料见表1。RTFQ-PCR结果显示，胃癌组织中miR-4295的表达水平较正常胃黏膜组织升高（图4C）。Pearson相关性分析表明胃癌组织中circSMARCA5与miR-4295的表达水平呈负相关（r=-0.571，P＜0.01，图4D）。RIP实验结果显示，与对照组相比，AGO2富集程度在LV-circSMARCA5组中更高（图4E）。RIP和荧光原位杂交（flurescenceinsituhybridization，FISH）实验结果进一步证实了circSMARCA5与miR-4295可直接结合（图4F和G）。RTFQ-PCR结果显示，与LV-NC组相比，LV-circSMARCA5组细胞中的miR-4295表达水平出现显著下降（P＜0.01，图4H）。以上结果表明，在胃癌细胞中circSMARCA5可与miR-4295结合，并靶向调控miR-4295表达。

表1 60例胃癌患者的临床病理学资料Tab.1 The clinicopathological features of 60 gastric cancer patients

图4 CircSMARCA5靶向调控miR-4295表达Fig.4 CircSMARCA5 directly targets miR-4295

2.5 上调miR-4295表达可部分逆转过表达circSMARCA5对胃癌细胞增殖和侵袭的影响

在circSMARCA5过表达组的AGS细胞中上调miR-4295表达水平，进行回复实验。结果显示，过表达circSMARCA5对胃癌细胞增殖、侵袭和糖酵解活性的抑制作用可被miR-4295 mimics部分挽救（图5）。

图5 CircSMARCA5通过靶向调控miR-4295表达抑制胃癌细胞增殖和侵袭Fig.5 CircSMARCA5 inhibits the proliferation and invasion of gastric cancer cells through targeting miR-4295

2.6 PTEN是miR-4295的下游靶基因

生物信息学预测结果提示miR-4295与PTEN存在互补结合的核苷酸序列，据此设计了miR-4295与PTEN结合位点的突变序列（图6A-B）。双荧光素酶报告基因实验结果显示：miR-4295 mimics+PTEN-WT共转染组的荧光素酶活性显著降低（P＜0.001），而miR-4295 NC+PTENMUT组和miR-4295 mimics+PTEN-MUT组的荧光素酶活性无明显改变（P＞0.05，图6C）。Pearson相关性分析结果表明胃癌组织中miR-4295与PTEN的表达水平成负相关（r=-0.421，P=0.001，图6D）。RTFQ-PCR结果显示，miR-4295 mimics组胃癌细胞中PTEN mRNA表达水平显著低于miR-4295 NC组（P＜0.001，图6E）。以上结果表明在胃癌细胞中miR-4295可与PTEN直接结合并下调PTEN的表达。

图6 PTEN是miR-4295的下游靶基因Fig.6 PTEN was a direct target gene of miR-4295

2.7 敲低PTEN 表达可部分逆转过表达circSMARCA5对胃癌细胞增殖和侵袭的影响

在circSMARCA5过表达组的AGS细胞中敲低PTEN表达水平，进行回复实验。结果显示，过表达circSMARCA5对胃癌细胞增殖、侵袭和糖酵解活性的抑制作用可被si-PTEN部分挽救（图7A ～ D）。本研究机制模式图见图7E。

图7 CircSMARCA5通过调控miR-4295/PTEN轴抑制胃癌细胞增殖和侵袭Fig.7 CircSMARCA5 inhibits the proliferation and invasion of gastric cancer cells through miR-4295/PTEN axis

3 讨 论

circRNA已被证实广泛参与了肿瘤的发生、发展过程［7］，并可作为肿瘤诊断、预后的分子标志物以及潜在的治疗靶点［8-10］。既往研究［11-12］发现，circSMARCA5在多种肿瘤中发挥了抑癌作用。circSMARCA5在肝癌组织中表达明显降低，上调circSMARCA5表达可抑制肝癌的侵袭转移［11］。在骨肉瘤中，circSMARCA5通过调控SRSF1表达，抑制肿瘤的侵袭转移［12］。circSMARCA5在胃癌中表达降低并能抑制胃癌细胞的增殖和侵袭［5］，本文在此基础上进一步探讨circSMARCA5调控胃癌增殖和侵袭的具体分子机制。

在氧含量正常的情况下，利用糖酵解是肿瘤细胞主要的能量来源，这种现象被称为Warburg效应［13］。Warburg效应为肿瘤细胞的快速增殖提供了足够的能量和营养，并且与肿瘤的侵袭转移存在着密切联系［14-15］。CircRNA可通过调节Warburg效应，影响肿瘤细胞的增殖和侵袭［6，16］。本研究发现circSMARCA5能够显著降低胃癌细胞的葡萄糖摄取和乳酸生成量，下调葡萄糖转运蛋白GLUT1和代谢酶LDHA的表达水平，从而抑制细胞糖酵解。

为了进一步研究circSMARCA5影响胃癌增殖和侵袭的分子机制，本研究通过ENCORI数据库预测miR-4295可与circSMARCA5特异性结合。既往文献报道miR-4295在胃癌、胰腺癌和膀胱癌等多种肿瘤中表达升高，与TNM分期及淋巴结转移具有明显的正相关性［17-19］，并可调控肿瘤细胞代谢重编程［20］，进而促进肿瘤进展。本研究结果发现，miR-4295在胃癌组织中表达较癌旁组织明显升高，并与circSMARCA5的表达水平呈负相关，FISH和双荧光素酶报告基因实验结果进一步证实了circSMARCA5可与miR-4295直接结合。

生物信息学预测miR-4295与PTEN mRNA的3′-UTR存在相互结合位点。PTEN是一个重要的代谢调控因子［21］，能够负调控PI3K/AKT信号转导通路，降低肿瘤细胞糖酵解，从而抑制肿瘤进展［22］。在本研究中，我们通过双荧光素酶报告基因实验进一步证实miR-4295与PTEN的相互结合，在胃癌组织中两者的表达呈负相关，并且在胃癌细胞中过表达miR-4295能够降低PTEN的表达。此外，回复实验结果表明，在circSMARCA5过表达组细胞中上调miR-4295或者下调PTEN表达可部分地逆转过表达circSMARCA5对胃癌细胞增殖、侵袭和糖酵解的抑制作用。

综上所述，circSMARCA5能够抑制胃癌细胞的增殖和侵袭，其分子机制可能是通过调控miR-4295/PTEN轴抑制胃癌细胞糖代谢重编程。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。