基于“药辅合一”的丁香酚乳膏的研制和药效研究

谢皓辰，陈金素，许蕊蕊，王秀丽*

1.北京中医药大学，北京 102488；2.云南省中医医院，云南 昆明 650021

“药辅合一”理论是中药制剂中的重要原则，通常指药物中某些药效成分兼任辅料的角色，以减少辅料的使用。辅料在中药制剂中，除了作为承载药效成分的基质外，还可以充当药效成分，一同帮助中药制剂发挥临床药效。由于中药成分的复杂性和治疗目的的多样性，在中药制剂的制备中，“药”与“辅”之间并没有明显的界限。利用药效成分的特殊物理化学性质，将其作为辅料，可以减少中药制剂中辅料的量，提升中药制剂的安全性和经济性。

丁香为桃金娘科植物丁香Eugenia caryophyllataThunb.的干燥花蕾，丁香酚是丁香挥发油中的主要药效成分，具有抗炎、抗氧化、抑菌和止痒的作用[1]。有研究表明，由于丁香酚结构中的苯酚类结构，使其即使稀释2000 倍，仍具有明显的抑菌效果[2]。因丁香酚确切的抗炎、抑菌效果与良好的促透作用，其常被制备成微乳剂、凝胶剂等外用制剂。但微乳剂制备相对困难、黏度低、对皮肤刺激性较大、不易在皮肤表面附着，且丁香酚水溶性差，不考虑制成水凝胶。脂凝胶虽有药物贮库效应，但丁香酚稳定性较差，不宜过多添加，因此也不宜制成凝胶剂[3]。相较于微乳剂与凝胶剂，乳膏剂制备工艺简单，可以均匀溶解药物有效成分，涂抹于皮肤可以使有效成分均匀释放，既起到隔离作用，可避免外来刺激和感染，又可消炎、止痛，改善局部血液循环，同时有利于创面组织的修复和再生。

本研究基于“药辅合一”这一中药复方制剂中的重要指导原则，以丁香酚为油相制备乳膏，既可以发挥丁香酚抗炎、止痒、抑菌的药理作用，又可以利用丁香酚良好的脂溶性和促透性[4]发挥其作为乳膏油相基质和促透剂的作用。

1 材料

1.1 仪器

CP225D 型电子分析天平（Sartorius 公司）；KQ-300DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BDS260 型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；101-1AB 型电热鼓风干燥箱（天津赛得利斯实验仪器分析制造厂）；3-18N 型台式高速离心机（湖南恒诺仪器设备有限公司）；SDPTOP SZN型解剖显微镜（尼康株式会社）。

1.2 试药

无水乙醇（分析纯，北京化工厂）；去离子水（实验室自制）；硬脂酸、丁香酚（批号分别为CG10070052、C11384667，上海麦克林生化科技有限公司，纯度≥99%）；单硬脂酸甘油酯（批号分别为CG10070082、C10286479，北京华威锐科化工有限公司）；甘油（批号：000619，北京化学试剂公司）；十二烷基硫酸钠（批号：1202021，广东省精细化学品工程技术研究开发中心）；尼泊金乙酯、羧甲基纤维素钠（批号分别为20190907、20151107，天津市福晨化学试剂厂）；复方醋酸地塞米松乳膏（广州白云山医药集团股份有限公司白云山何济公制药厂）；二甲苯（批号：20091020，重庆川东化工集团有限公司）；大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌（批号分别为19089037、17121207，北京北纳创联生物技术研究院）。

1.3 实验动物

SPF 级昆明种小鼠100 只，雌雄各半，体质量18～22 g，生产许可证号：SCXK（京）2016-0002，购于北京斯贝福实验动物科技有限公司，经过北京中医药大学实验动物伦理委员会批准（BUCM-4-2019091004-3105），饲养于北京中医药大学动物房。

2 方法

2.1 Box-Behnken 响应面法筛选丁香酚乳膏基质处方

2.1.1实验设计 预实验结果表明，硬脂酸、单硬脂酸甘油酯和丁香酚的用量是影响丁香酚乳膏质量的主要因素。因此，探究不同水平下丁香酚用量（A）、硬脂酸用量（B）和单硬脂酸甘油酯用量（C）对综合评分（Y）的影响，见表1。本实验将以Y为评价指标，每个因素设置低、中、高3 个水平，通过Box-Behnken 响应面法来探究丁香酚乳膏的最优配方。

表1 Box-Behnken响应面法优化丁香酚乳膏基质处方试验设计

2.1.2评价指标和方法 本研究参考相关文献标准，将从均匀性、涂布延展性、离心稳定性、耐寒稳定性和耐热稳定性方面评价丁香酚乳膏质量并评分[5-6]，用最终综合评分来筛选出最优配方。丁香酚乳膏基质评价标准见表2。按公式（1）计算综合评分。

表2 丁香酚乳膏基质评价标准

各项指标评价方法：1）均匀性。取样品适量，观察丁香酚乳膏颜色、光泽是否均一，质地是否光滑，静置1 h是否自然分层；2）涂布延展性。取样品适量，在载玻片上涂布，涂布过程中观察有无结块，是否产生颗粒；3）离心稳定性。分别取出等量乳膏于2个2 mL的离心管中，4000 r·min-1离心15 min（离心半径为5 cm），注意有无气泡产生，有无分层、变色等油水分离的现象；4）耐寒稳定性。分别取等量乳膏于3 个2 mL 的离心管中，密封，置-20 ℃保存24 h，取出放至室温，观察有无气泡产生，是否发生分层、变色等油水分离的现象；5）耐热稳定性。分别取等量乳膏于3 个2 mL 的离心管中，密封，置50 ℃恒温箱中，恒温保持6 h，观察有无气泡产生，是否发生分层、变色等油水分离现象。

2.2 二甲苯致小鼠耳肿胀实验

取昆明种小鼠50只，体质量（20±2）g，雌雄参半，随机分成低、中、高剂量组、阳性对照组及空白乳膏组，共5组，每组10只。在空白乳膏组小鼠右耳耳廓内外均匀涂抹空白乳膏0.1 g·kg-1；低、中、高剂量丁香酚乳膏组，分别在小鼠右耳耳廓内外均匀涂抹丁香酚乳膏0.1 g·kg-1；阳性对照组，在小鼠右耳耳廓内外均匀涂抹复方醋酸地塞米松乳膏0.1 g·kg-1。各项处理均为2次/d，共处理7 d。每次给药前，先用0.9%氯化钠溶液清洗小鼠耳廓，待皮肤干燥后给药。另外，各组均同时给左耳涂抹与右耳等质量的0.9%氯化钠溶液。第7天涂药20 min后，对各组小鼠左右耳涂抹0.05%二甲苯溶液致炎，每只0.05 mL，40 min后，脱颈椎处死小鼠，剪下双耳，在双耳相同部位打下8 mm圆耳片，称质量，以左耳作对照，左右耳片质量差为肿胀程度，依据公式（2）求出肿胀抑制率[7]。

2.3 体外抑菌实验

从-80 ℃冰箱取冻存的大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌菌种，室温解冻，在超净台中分别接种于肉汤培养基中。在37 ℃的环境下，培养24 h。选用标准菌落接种于液体培养基中培养6 h，调整菌液吸光度为0.1后备用。

取无菌液体培养基20 mL 于直径为9 cm 的培养皿中，室温冷凝固化。取备用菌液50 μL，均匀涂布于培养基表面，用直径为6 mm 的打孔器在中央位置打孔，并用所制高、中、低剂量的丁香酚乳膏填满缺孔，密封后置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。取出测量抑菌环直径。每个剂量均设3 个平行组。

2.4 磷酸组胺致小鼠瘙痒实验

取昆明种小鼠50 只，体质量为（20±2）g，雌雄各25 只。实验前1 d 用脱毛膏脱去颈部毛发，脱毛局部均未出现明显的损伤。将小鼠随机分成5 组，分别为低、中、高剂量丁香酚乳膏组、阳性对照组及空白乳膏组，每组10 只。每只小鼠在脱毛处涂抹0.05%磷酸组胺溶液20 μL，30 min内小鼠如不呈现抓挠动作（即后爪连续搔抓磷酸组胺涂抹部位），需再次涂抹磷酸组胺，直至出现瘙痒反应为止，记录磷酸组胺的累计用量。低、中、高剂量药物组分别在小鼠颈部脱毛处均匀涂抹丁香酚乳膏0.1 g·kg-1，阳性对照组在小鼠颈部脱毛处均匀涂抹复方醋酸地塞米松乳膏0.1 g·kg-1，空白乳膏组在小鼠颈部脱毛处均匀涂抹空白乳膏0.1 g·kg-1，每天3次，连续3 d，每次给药前，用0.9%氯化钠溶液清洗小鼠颈部脱毛处，待0.9%氯化钠溶液干燥后给药，连续处理6 d。第7天给药后，在创面处涂抹0.05%磷酸组胺20 μL，于无干扰环境下观察小鼠30 min 内搔抓总次数，并记录数据。

2.5 统计学处理

采用SPSS 16.0软件对数据进行统计分析。实验数据均以（）表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 处方优化结果

3.1.1Box-Behnken 响应面法筛选处方实验设计及其结果 Box-Behnken 响应面法筛选处方实验设计结果见表3。

表3 丁香酚乳膏处方优化实验设计及评分结果

3.1.2模型拟合 运用Design-Expert V8.0.6.1 软件，以Y对自变量进行模型拟合，使用相关系数（r）评价拟合模型，通过比较拟合度，得到回归方程Y=96.00+3.25A+3.25B+0.94C-3.75AB-2.81AC-3.44BC-11.63A2-9.12B2-15.82C2，方差分析见表4。由此可知，r=0.995 5，P＜0.000 1，F值为173.86，表明模型具有极显著差异性；失拟项P=0.106 9＞0.05，失拟项不显著，说明该模型精确度和精密度均较好，试验误差小，可以用此模型对丁香酚乳膏处方进行分析和预测。

表4 丁香酚乳膏多元回归模型方差分析结果

3.1.3响应面优化分析 运用Design-Expert V8.0.6.1 软件，绘制不同影响因素对综合评分的等高线图和响应面图，以获知各影响因素的交互作用对综合评分的影响。

由图1～3 可知，丁香酚、单硬脂酸甘油酯和硬脂酸的用量对综合评分均成抛物线形，即随着因素的增大，综合评分呈先增大后降低的趋势，因此，在提取工艺中适当提高三者比例可以提高综合评分。通过软件分析以上各项数据，并结合实际可操作性，确定最佳处方为丁香酚的用量为1.0 g、硬脂酸的用量为1.65 g、单硬脂酸甘油酯的用量为0.75 g，该处方实际操作性好，可以作为丁香酚乳膏的最优基本基质处方。

图1 丁香酚用量和硬脂酸用量对综合评分的影响

图2 丁香酚用量和单硬脂酸甘油酯用量对综合评分的影响

图3 硬脂酸用量与单硬脂酸甘油酯用量对综合评分的影响

3.2 乳膏的制备方法

将硬脂酸1.65 g、单硬脂酸甘油酯0.75 g、丁香酚1.00 g放置于坩埚内，水浴加热至液态，继续加热至75～80 ℃，将所得液体作为油相；另取处方量的十二烷基硫酸钠、甘油和蒸馏水置于坩埚内，水浴加热至溶化，继续加热至75～80 ℃，将所得的液体作为水相。将油相缓缓倒入水相中，边加边搅拌，待乳化完全后，从水浴锅上取下，密封于阴凉处放置即得。将无药效作用的中链甘油三酸酯代替处方中的丁香酚，按同样方法即可制得空白乳膏。将处方中丁香酚用量替换为0.75、0.50 g，则分别得中剂量乳膏和低剂量乳膏。

3.3 丁香酚乳膏对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响

实验结果表明，与空白乳膏组相比，高、中、低剂量丁香酚乳膏组和阳性对照组均能有效降低小鼠两耳片质量的差值，减轻小鼠耳肿胀情况，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），且高剂量组的肿胀抑制率为72.60%，高于阳性对照组，表明丁香酚乳膏可以抑制二甲苯引起的炎症，具有明显的抗炎效果，具体结果见表5。

表5 丁香酚乳膏对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的抑制作用（,n=10）

表5 丁香酚乳膏对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的抑制作用（,n=10）

注：乳膏用量均为0.10 g·kg-1；与空白乳膏组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；表7同。

3.4 丁香酚乳膏体外抑菌实验结果

抑菌圈的检测是为了对比丁香酚乳膏不同剂量组的抑菌活性大小，抑菌圈越大，说明抑菌活性越好。抑菌圈直径为6 mm即为与打孔器直径相同，无抑菌作用。对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈检测结果表明，丁香酚乳膏对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用，且相同的给药剂量下丁香酚乳膏对金黄色葡萄球菌的抑制作用更强，具体结果见表6。

表6 丁香酚乳膏体外抑菌作用（,n=3）

表6 丁香酚乳膏体外抑菌作用（,n=3）

3.5 丁香酚乳膏对磷酸组胺致小鼠瘙痒反应的影响

与空白乳膏组相比，中、高剂量丁香酚乳膏组可以减少磷酸组胺所致的小鼠搔抓次数（P＜0.05），且随给药剂量的增大，抗瘙痒效果更趋明显，阳性对照组可以显著减少搔抓次数（P＜0.01），表明丁香酚乳膏可以抑制磷酸组胺引起的瘙痒反应，提示丁香酚乳膏具有止痒效果，具体结果见表7。

表7 丁香酚乳膏对磷酸组胺致小鼠瘙痒的抑制作用（,n=10）

表7 丁香酚乳膏对磷酸组胺致小鼠瘙痒的抑制作用（,n=10）

4 讨论

通过检索相关文献，发现以丁香酚为主要药用物质的制剂主要有丁香酚微乳剂、丁香酚微乳凝胶、丁香酚凝胶与丁香酚纳米乳等，常用于杀螨、抗炎、镇痛[8-12]。由此可见，在利用丁香酚的油性物质性质将其制成乳膏，用于抗炎、止痒的研究领域存在一定的空白，且乳膏剂相较于微乳剂与纳米乳剂，制备工艺简单、稳定性强，可以均匀溶解药物有效成分，更好地发挥药效。但曾有研究报道，7月龄婴儿误食丁香酚出现蛋白尿病变及凝血病；动物实验表明，丁香酚会引起胃肠炎和厌食症[2]。因此，在使用丁香酚乳膏的过程中，应注意不要入口，不建议给婴幼儿使用。

“药辅合一”理论是传统中药制剂理论与实践成果中的思想精华，蕴含着实践的智慧。本研究中丁香酚具有良好的脂溶性且热稳定性良好，因此，可以作为油相中的良好基质，参与构成稳定的乳膏结构。另外，丁香酚具有较强的促透性，其促皮吸收机制与薄荷醇相似，既能直接毁坏角质层细胞的脂质屏障，又能改变细胞内Ca2+平衡，影响细胞膜膜电位，破坏角质层的屏障功能[13]，发挥促渗透效果。丁香酚不仅可以作为丁香酚乳膏的主要成型辅料，自身也具有较强的药效作用，体现了“药辅合一”制剂理念中“药之为辅”与“辅之为药”的设计应用规律。这一制剂理念不仅可以用于指导中药制剂方法的创新，还能启示辅料对于制剂的巨大价值，对于开发新型辅料等具有重大意义。同时，也需要跟进新型药用辅料的不良反应、使用条件和与之配套的质量检测方法研究，以期对“药辅合一”理念有更加科学、标准的应用。

5 结论

综上所述，本研究制得的丁香酚乳膏具有优良的抗炎、止痒效果和一定的抑菌作用。该乳膏的研制为丁香酚新用途的探索和丁香临床应用的拓展提供了参考。