基于“药辅合一”的艾叶油乳膏的研制及药效研究

许蕊蕊，陈金素，李越，王秀丽*

1.北京中医药大学，北京 102488；2.云南省中医医院，云南 昆明 650021

艾叶为菊科植物艾Artemisia argyiLevl.Et Vant.的干燥叶，入药始载于《名医别录》，其提取物艾叶油具有抗炎、止痒、抑菌、增强机体免疫力等作用[1]。通过检索相关文献发现，以艾叶油为主要药用物质的制剂主要有艾叶油乳-水凝胶贴膏剂、艾叶油微乳剂、艾叶油微胶囊和艾叶油驱蚊乳液等，其常用于抑菌织物制造和驱蚊[2-5]。由此可见，在艾叶油乳膏的处方优化及药效评价研究领域存在一定的空白。

鉴于挥发油的促透特性及艾叶油的抑菌作用，本研究在“药辅合一”理论指导下，尝试制备艾叶油乳膏。艾叶油在乳膏中既发挥了抗炎、止痒的药效作用，也充当了油相、抑菌剂、促透剂等辅料角色，替代或减少了化学辅料的应用，实现了加工与应用的经济性与安全性，实现了艾叶油“药之为辅，辅之为药”的药辅价值，拓展了艾叶油的应用范围，也为临床新型制剂的开发提供了参考。

1 材料

1.1 仪器

FA1204B 型分析天平（上海精密仪器仪表有限公司）；3-18N 型台式高速离心机（湖南恒诺仪器设备有限公司）；BDS260 型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；BCD-182KZ50 型电冰箱（TCL 家用电器有限公司）；Captair Bio 321 Smart 型超净台（法国Erlab公司）；HDM-型电子调温电热套（常州荣华仪器制造有限公司）；101-1AB 型电热鼓风干燥箱（天津赛得利斯实验仪器分析制造厂）；挥发油提取器（河南九和共创仪器有限公司）；打孔器（上海远卓文教用品有限公司）；SP60 型X-rite 色差仪（爱色丽色彩仪器商贸有限公司）。

1.2 试药

艾叶饮片购于安国中药材市场，经北京中医药大学廖艳副教授鉴定为正品，符合《中华人民共和国药典》2020年版相关项下的要求。

硬脂酸（上海麦克林生化科技有限公司，批号：CG10070082）；单硬脂酸甘油酯（北京华威锐科化工有限公司，批号：C10286479）；甘油（北京化学试剂公司，批号：000619）；十二烷基硫酸钠（广东省精细化学品工程技术研究开发中心，批号：1202021）；二甲苯（重庆川东化工集团有限公司，批号：20091020）；中链甘油三酸酯、月桂氮䓬酮、右旋糖酐（上海源叶生物科技有限公司，批号分别为Y19J12C137892、Z13J10Y93008、S14098）；复方醋酸地塞米松乳膏、糠酸莫米松乳膏（广州白云山医药集团股份有限公司白云山何济公制药厂）；冰片（上海迈瑞尔化学技术有限公司，批号：76747220）；金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌（北京北纳创联生物技术研究院，批号分别为17121207、19089037）；肉汤培养基（北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：20190612）；无水乙醇（分析纯）；去离子水实验室自制。

1.3 实验动物

SPF 级昆明种小鼠100 只，雌雄各半，体质量18～22 g，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0002，购于北京斯贝福实验动物科技有限公司，经过北京中医药大学实验动物伦理委员会批准（BUCM-4-2019091004-3105），饲养于北京中医药大学动物房。

2 方法

2.1 艾叶油乳膏的制备方法

2.1.1艾叶油的提取 采用水蒸气蒸馏法提取艾叶油[6]：取干艾叶一定量，置于硬质圆底烧瓶中，加蒸馏水10倍量，用玻璃棒将其混合均匀，浸泡2 h。安装挥发油提取器和冷凝管，回流提取6 h，收集艾叶油。

2.1.2Box-Behnken响应面法优选艾叶油乳膏基质处方

2.1.2.1 试验设计 根据参考文献[7]和预试验确定用量范围，利用Design-Expert V8.0.6.1软件进行星点设计[8]，选择艾叶油用量（A）、单硬脂酸用量（B）、十二烷基硫酸钠用量（C）为考察因素，每个因素选取高、中、低3个水平，设计因素水平见表1。

表1 艾叶油乳膏基质处方筛选星点试验因素水平

2.1.2.2 考察指标及评价方法 根据参考文献[9]和预试验情况反馈，确定评价方法和标准：1）光泽度。取样品适量，目检外观颜色是否一致、是否有光泽。2）均匀度。取样品适量，目检外观是否有明显颗粒，膏体是否均匀细腻。3）涂布延展性。取样品适量，在滤纸上小心涂布，观察其均匀涂布过程中是否产生颗粒，记录结果并评分。4）离心稳定性。取艾叶油乳膏适量，于2 mL的离心管中，4000 r·min-1离心15 min（离心半径为5 cm），观察是否发生分层、变色等油水分离现象，记录结果并评分。5）耐寒性。取艾叶油乳膏适量于2 mL的离心管中于-20 ℃放置24 h，取出放至室温，观察实验样品是否发生分层、变色等油水分离现象，记录结果并评分。6）耐热性。取艾叶油乳膏适量于2 mL的离心管中，密封，于50 ℃电热鼓风干燥箱中，恒温保持6 h，观察上述实验样品是否发生分层、变色等油水分离现象，记录结果并评分。

评分处理[10]：光泽度、均匀度、涂布延展性、离心稳定性、耐热稳定性、耐寒稳定性各占16.67%，共100分，具体评分标准见表2～3。

表2 艾叶油乳膏基质表观评价标准

表3 艾叶油乳膏基质稳定性评价标准

2.1.2.3 验证实验 根据最佳处方平行制备3 份样品，得到基质为黄色、表面光泽、均匀、细腻的半固体。采用X-rite 色差仪测量3批艾叶油乳膏的视感明度（L*）、色相（a*）、彩度（b*）值，差异无统计学意义。L*值为0～100，L*值大者接近白色，小者接近黑色。

2.2 药效学实验

2.2.1二甲苯致小鼠耳肿胀实验 取小鼠50只，雌雄各半，随机分为低、中、高剂量药物组，阳性对照组及空白乳膏组5组，每组10只。低、中、高剂量药物组分别在小鼠右耳耳廓均匀涂抹艾叶油乳膏0.5、1.0、2.0 g·kg-1，阳性对照组在小鼠右耳耳廓均匀涂抹复方醋酸地塞米松乳膏1.0 g·kg-1，空白乳膏组在小鼠右耳耳廓均匀涂抹空白乳膏（将无药效作用的中链甘油三酸酯代替处方中的艾叶油，按同样方法即可制得空白乳膏）1.0 g·kg-1，每天3次，连续3 d，每次给药前，先用0.9%氯化钠溶液清洗给药处，待皮肤干燥后给药。第4 天涂药1 h 后，对各组小鼠右耳给予二甲苯0.05 mL 致炎，1 h 后将小鼠颈椎脱臼处死，剪下双耳，用直径为8 mm打孔器将双耳相同部位打下圆耳片，称质量，以左耳为对照，左右耳片质量差为肿胀度，计算各组肿胀度，按公式（1）计算肿胀抑制率。

2.2.2右旋糖酐致小鼠瘙痒实验 取小鼠50 只，雌雄各半，随机分为低、中、高剂量药物组，阳性对照组及空白乳膏组5 组，每组10 只。低、中、高剂量药物组分别在小鼠左后足均匀涂抹艾叶油乳膏0.50、0.75、1.00 g·cm-2，保持30 min；阳性对照组在小鼠左后足均匀涂抹糠酸莫米松乳膏0.50 g·cm-2；空白乳膏组在小鼠左后足均匀涂抹空白乳膏0.50 g·cm-2。30 min 后用0.9%氯化钠溶液将药物洗净，在小鼠左后足脚垫内注射右旋糖酐0.2 mL，自小鼠开始舔后足作为瘙痒指征，观察并记录10、15 min 内小鼠舔后足次数[11-12]。

2.3 统计学处理

采用SPSS 16.0软件对数据进行统计分析。实验数据均以（）表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果与讨论

3.1 处方优化实验结果

3.1.1Box-Behnken 响应面法优选处方试验设计及其结果 Box-Behnken响应面法优选处方试验设计结果见表4。

表4 艾叶油乳膏基质处方星点试验设计与评分结果

3.1.2模型拟合 采用Design-Expert V8.0.6.1 对数据进行分析，以综合评分对各因素进行模型拟合，并通过相关系数（r）等对拟合模型进行评价，得到二次多项式回归方程Y=97.60-1.12A-2.87B-0.50C+5.25AB-1.50AC-16.68A2-18.18B2-21.92C2，方差分析见表5。由此可知，r=0.996 4，P＜0.01，F值为19.90，表明模型具有极显著差异性；失拟项P=0.007 0＜0.001，失拟项极显著，说明该模型拟合度和可信度均有效，实验误差小，可以用此模型对该处方进行分析和预测。

表5 艾叶油乳膏多元回归模型方差分析

3.1.3响应面优化分析 根据拟合方程，通过Design-Expert V8.0.6.1 软件绘制评价指标随因素变化的等高线图和响应面图（图1～3）。

由图1～3可以看出，艾叶油、单硬脂酸甘油酯和十二烷基硫酸钠的用量对综合评分均成抛物线形，即随着因素的增大，综合评分呈先增大后降低的趋势，因此，在提取工艺中适当提高三者比例可以提高综合评分。根据回归模型分析且考虑实际操作的可行性，艾叶油乳膏最优处方为艾叶油2.00 g，单硬脂酸甘油酯0.75 g，十二烷基硫酸钠0.30 g。

图1 艾叶油用量和单硬脂酸甘油酯用量对综合评分的影响

3.2 艾叶油乳膏的制备方法

将硬脂酸1.65 g、单硬脂酸甘油酯0.75 g、艾叶油2.00 g、月桂氮䓬酮0.13 g和适量冰片放置于容器内，水浴加热至熔化，继续加热至70～80 ℃；另取处方量十二烷基硫酸钠、甘油和适量蒸馏水（加至乳膏总量10 g），加热至70～80 ℃，缓缓倒入硬脂酸等油相中，边加边搅拌，至乳化完全，放冷即得。

3.3 色差仪检测结果

制得的3批艾叶油乳膏色差仪检测结果见表6。由表6可知，利用色差仪测得的3批艾叶油乳膏的L*、a*、b*值差异无统计学意义，表明3批艾叶油乳膏色泽均匀。

表6 3批艾叶油乳膏的色差仪检测结果

图2 艾叶油用量和十二烷基硫酸钠用量对综合评分的影响

图3 单硬脂酸甘油酯用量和十二烷基硫酸钠用量对综合评分的影响

3.4 艾叶油乳膏对二甲苯致炎反应的影响

结果表明，空白乳膏组小鼠耳廓肿胀度为11.62 mg，低、中、高剂量药物组小鼠耳廓肿胀度分别为9.35、7.79、6.80 mg，与空白乳膏组比较，低、中、高剂量药物组及阳性对照组小鼠耳廓肿胀度均明显减轻，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），且艾叶油乳膏高剂量抗小鼠耳廓肿胀的效果优于阳性对照组，各给药组抑制二甲苯致小鼠耳廓肿胀的能力为高剂量组＞阳性对照组＞中剂量组＞低剂量组，表明艾叶油乳膏能明显抑制二甲苯所致的小鼠耳廓炎症，提示艾叶油乳膏具有抗炎的作用，结果见表7。

表7 艾叶油乳膏对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响（,n=10）

表7 艾叶油乳膏对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响（,n=10）

注：与空白乳膏组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；表8同。

3.5 艾叶油乳膏对右旋糖酐致小鼠瘙痒反应的影响

由表8 可知，右旋糖酐致小鼠瘙痒后，空白乳膏组小鼠10、15 min 时瘙痒次数分别可达12、14次，而各给药组小鼠的瘙痒次数明显减少，与空白乳膏组相比差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。说明艾叶油乳膏可显著改善右旋糖酐导致的小鼠瘙痒，且随给药剂量的增大，抗瘙痒效果更趋明显，提示艾叶油乳膏具有止痒的作用，具体结果见表8。

表8 艾叶油乳膏对右旋糖酐所致小鼠瘙痒次数的影响（,n=10）

表8 艾叶油乳膏对右旋糖酐所致小鼠瘙痒次数的影响（,n=10）

4 讨论

4.1 艾叶油乳膏的抗炎作用

现有研究表明，艾叶油可以有效降低白细胞介素-6（IL-6）、IL-1β和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）炎症因子的表达和分泌[13]。因此，艾叶油可以作为治疗炎症疾病的有效药物。本研究选取了二甲苯致炎作为急性炎症模型，其容易复制、重现性好、操作简便，是一种常见的科学可靠的实验动物模型。实验结果显示，与空白乳膏组相比，艾叶油乳膏低、中、高剂量,对二甲苯所致耳肿胀急性炎症模型小鼠的耳肿胀均有显著的抑制作用（P＜0.05，P＜0.01）。相较于李波[14]的实验结果，本实验中高剂量艾叶油乳膏组的抗炎作用强于其艾叶油稀释液高剂量组。相较于熊莹[2]的实验结果，本实验中高剂量艾叶油乳膏组的抗炎作用略弱于其艾叶油高剂量组，可能是由于乳膏基质阻挡了艾叶油与小鼠皮肤的接触。

4.2 艾叶油乳膏的止痒作用

瘙痒是一种仅有皮肤瘙痒而无原发性皮肤损害的皮肤病症状。目前，瘙痒模型的制备方法主要有直接使用特定种系动物法、炎症介质刺激法、化学物质刺激法等，其中较为常用的主要是炎症介质刺激法和化学物质刺激法[15]。本研究选取的是右旋糖酐致小鼠瘙痒模型，该模型重现方法简便易行，不会引起其他继发反应，且症状与临床接近。瘙痒次数可直观反映瘙痒情况，也可直接证明艾叶油乳膏的药效作用。实验结果显示，艾叶油乳膏低、中、高剂量均可显著减少右旋糖酐致小鼠的瘙痒次数（P＜0.05，P＜0.01），且高剂量组与阳性对照组差别不大，说明艾叶油乳膏外用治疗瘙痒有较明显的作用。

4.3 艾叶油乳膏“药辅合一”特性的体现

本研究每组实验均设置了空白乳膏组，通过观察含/不含艾叶油的乳膏对小鼠的消炎止痒作用，从而初步判断该乳膏中艾叶油除辅助制剂成型外，是否具有一定的药效作用。结果表明，和空白乳膏组相比，各给药组均能显著发挥抗炎、止痒的药效作用，表明艾叶油不仅可以作为艾叶油乳膏的主要成型辅料，自身也具有较强的药效作用。除此之外，外用制剂的透皮作用也是制备乳膏时的难点、要点，大多数外用乳膏制备时会加入一定量的化学促透剂来提高其促透性能，其实中药中的挥发油或芳香类成分就可以促进药物的吸收与跨膜转运，兼有促进渗透与治疗疾病的双重特点[16]。已有研究表明，一些萜烯类的中药挥发油可以直接破坏角质层细胞脂质屏障，影响细胞膜流动性及膜电位，通过增加皮肤活性表皮流动性来降低皮肤角质层的屏障作用，发挥促渗透效果[17]。而艾叶油的主要化学成分为单萜、倍半萜、烯类和黄酮类等，因此推测其促透作用机制同上[18]。不仅如此，活血化瘀和芳香开窍类的中药也能提高皮肤细胞的通透性、刺激皮肤腺体开口增大、改善微循环及机体血流动力学[19]，而艾叶作为此类中药的代表药，理论上也可通过该途径促进药物渗透吸收。

5 结论

综上所述，艾叶油乳膏的成型工艺及药效评价证实了本课题组所构思的辅料不仅起成型促透作用，同时也起到一定药效作用，证明了“药辅合一”思路的可行性及开发新型辅料的重要性。