贮藏方式对伊犁绢蒿种子萌发及生理特性的影响

武文超，汤丽斯，刘慧霞，崔雨萱，孙强，孙宗玖,3

(1.新疆农业大学草业与环境科学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆维吾尔自治区草原总站，新疆 乌鲁木齐 830049；3.新疆草地资源与生态自治区重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830052)

种子活力是检验种子品质的重要指标，也是衡量种子寿命长短的重要依据。高活力种子具有明显的生长优势和生产潜力，在农业生产方面具有十分重要的意义[1]。种子活力以及寿命因植物种类不同而存在明显差异，如在常温贮藏下绿豆(Vignaradiata)、小豆(V.ahgularis)种子寿命可达数十年，而柳树(Salixbabylohica)种子寿命只有短短几十个小时[2]。同时，种子活力也与其成熟度、贮藏温度、贮藏湿度、基质等因素息息相关[3]。如垂穗披碱草(Elymusnutans)在盛花期后25～31 d收获，其种子活力最大[4]；花生(Arachishypogaea)[5]、於术(Atractylodesmacrocephala)种子低温贮藏可有效延缓老化[7]；-15 ℃贮藏10个月的扁穗冰草(Agropyroncristatum)种子发芽率显著高于20 ℃贮藏处理，而胚根长、胚芽长则因种子含水量差异表现并不一致[6]。因此，寻找适宜贮藏条件对优良种质资源长期贮藏具有重要现实意义和应用价值。

目前，不同贮藏方式对种子活力的影响已有较多报道，研究物种多为作物、蔬菜、花卉等，方式主要集中于低温贮藏、液氮超低温贮藏、干藏、真空或不同因素组配[8-9]，且其影响种子活力的生理生化机制可能有所不同。种子千粒重、含水率反映种子饱和度及质量[11]，发芽率、发芽势及发芽指数反映其萌发活力及其整齐度，胚根长、胚芽长和幼苗干重反映种子萌发后幼苗生长的茁壮度[12]，而可溶性糖含量则为种子萌发提供能量供给，决定其是否能正常萌发为成株[13-14]，相对电导率则表征种子细胞膜结构和功能完整性，反映了其活力保持状态[15]。真空密封包装可使普通小麦(Triticumaestivum)种子糖类物质高于室温贮藏，延长其贮藏期限[8]。霍平慧等[9]指出，超干处理后苜蓿(Medicagosativa)种子发芽率明显提高，相对电导率显著降低。液氮超低温贮藏3年的粮食、蔬菜、花卉等21个品种种子发芽率无显著变化，但生长势降低、酶活性升高[10]。相对而言，有关草种质特别是生态修复野生种质种子的最佳储藏方式研究相对较少。

伊犁绢蒿(Seriphidiumtransiliense) 作为菊科绢蒿属半灌木，具有抗旱、抗寒、耐牧、营养价值高、寿命长和适应性强等特点[16]，是新疆退化荒漠草地补播的首选草种之一。目前，随荒漠草地生态修复项目的实施，伊犁绢蒿种子需求量日益增多，导致其种子采收量大幅增加，但其种子多在常温下贮藏，这可能会影响其种子萌发活力，进而影响其补播成效。伊犁绢蒿种子多在10月收获[17]，而播种一般在翌年3月才开始进行，导致其在常温下贮藏时间达到半年甚至更久。同时，野外退化草地补播时，初期伊犁绢蒿种子会大量发芽，但后期萌发的幼苗出现大量死亡[18]，这可能与种子贮藏过程中自身贮藏能量消耗过多，导致其萌发后期能量供应不足有关。因此，为了更好地保存伊犁绢蒿种子活力，本研究采用贮藏温度(常温、零上低温、零下低温)、包装条件(真空、非真空)双因素实验设计，以贮藏6个月的种子为对象，通过对其萌发特征、生长指标、相对电导率及可溶性糖的测定，明确不同贮藏方式对其种子活力相关指标的影响，筛选最佳贮藏方式，以期为生产中伊犁绢蒿种子的高质量保存提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试验材料

伊犁绢蒿野生种子于2019年10月31日采自乌鲁木齐水磨沟区伊犁绢蒿荒漠草地(N 43°47′，E 87°41′，海拔453 m)。在试验区内随机布设5个10 m×10 m的样方，齐地刈割后形成混合样带回室内[19]。室内自然风干、脱粒后立即用自封袋进行贮藏。贮藏前伊犁绢蒿种子可溶性糖含量为(11.1±0.1)mg/kg，相对电导率为(10.6±0.3)%，千粒重为(179.4±2.5)mg，种子含水率为(8.1±0.6)%，发芽率为(88.0±1.6)%。

1.2 实验设计

采用双因子(贮藏温度、包装条件)实验设计[20]，贮藏温度设置常温(15～25 ℃)、零上低温(3～5 ℃)、零下低温(-15～-20 ℃)3个处理，包装条件设置真空(-50～-60 kPa)、非真空(乌鲁木齐地区的标注大气压：0.9 kpa)2个处理，总计6个处理组合，即常温贮藏(N)、常温真空贮藏(NZ)、零上低温贮藏(C)、真空零上低温贮藏(CZ)、零下低温贮藏(F)、真空零下低温贮藏(FZ)。贮藏时间为6个月。

纸上萌发实验：萌发实验开始前，每种贮藏方式取大小一致、籽粒饱满的伊犁绢蒿种子4份，每份50粒。种子经70%酒精消毒30～60 s，蒸馏水冲洗3～5次后，置于直径为 90 mm，铺有双层滤纸的玻璃培养皿中，在光照培养箱(GTOP-380B，浙江托普仪器有限公司) 中进行发芽实验。发芽温度为昼25 ℃/夜15 ℃(昼/夜=12 h/12 h)，光强为110 μmol/(m2·s) 。自种子着床之日起，以胚根突破种皮1 mm，胚芽为种子长1/2作为发芽标准，每日定时记载种子发芽数，补充蒸馏水，15 d结束萌发实验，计算种子萌发指标。

发芽率%=发芽种子数/参试种子总数×100%；

发芽势%=7天内发芽种子数/参试种子总数×100%；

发芽指数Gi=∑Gt/Dt

式中：Gi为发芽指数；Gt为在时间t的发芽数；Dt为相应的发芽天数。

实验结束时立即进行胚根长、胚芽长及幼苗干重的测定。每培养皿随机选取幼苗10株，用精度为1 mm刻度尺测量其胚根长及胚芽长，用精度0.1 mg电子天平称取10株幼苗干重(80 ℃，24 h)[21]。

盆栽实验：与种子萌发实验同时进行。将各处理下贮藏的伊犁绢蒿种子播种于花盆 (直径15 cm，深 20 cm，干土重 400 g) 中，每盆 100 粒，播种深度2 mm，重复4次。播后用喷壶均匀洒水，直至土壤湿透，最后将花盆置于室内有日光照射的地方培养。为了避免外界条件的干扰，花盆随机排列，每天调整位置，并保持表土湿润。逐日统计出苗数，15 d结束萌发实验，并计算出苗率。出苗率%=出苗种子数/参试种子总数×100%。实验结束时立即随机选取5株幼苗进行干重(80 ℃，24 h)测定。

1.3 贮藏种子相关指标的测定

对不同贮藏方式下伊犁绢蒿种子进行千粒重、含水率、相对电导率、可溶性糖的测定，其中千粒重用精度0.1 mg电子天平直接称量，含水率采用烘干法[21]，均重复3次；相对电导率采用电导法[22]，可溶性糖采用蒽酮比色法[22]，均重复4次。

相对电导率的测定[22]：称取伊犁绢蒿种子0.1 g，用蒸馏水冲洗5次，吸干表面附水后，加双蒸水6 mL，用电导仪测定浸泡液的初始电导率值(a1)，然后加盖置于20 ℃恒温培养箱中6 h，测定浸出液电导率(a2)，再将其置于100 ℃水中煮沸1 h，冷却至室温，测定浸泡液电导率(a3)，按照公式(1)进行计算。

相对电导率(%)=(a2-a1)/(a3-a1)×100%

(1)

可溶性糖的测定[22]：称取研磨至粉末状的伊犁绢蒿种子0.1 g置于试管中，加入5 mL蒸馏水后封口，置于沸水中提取30 min，冷却后过滤，定容在25 mL容量瓶内。吸取0.5 mL定容液，加蒸馏水1.5mL,加入1 mL 9%苯酚溶液，摇匀，再快速加入5ml浓硫酸，摇匀，显色并测定光密度。由标准曲线方程(y=0.904 5x-0.027 2，R2=0.999)计算可溶性糖含量。

1.4 数据分析

采用SPSS 23.0 软件中Two-way ANOVA 分析试验因素对测试指标的效应；利用One-way ANOVA进行6个处理组合间测试指标差异分析。利用Origin 2018 绘图，数据以“均值±标准差”表示。

采用SPSS 23.0对供试指标进行主成分分析，结合隶属函数评价法[23]筛选伊犁绢蒿种子最适贮藏方式。首先按照公式(2)进行指标数据标准化处理，然后按照公式(3)、(4)、(5)、(6)依次计算标准差系数(St)、权重系数(Ct)、隶属函数值(Dt)及综合评价值(E)。

(2)

(3)

(4)

Dt=R(xt)×Ct

(5)

(6)

式中：t=1,2,3,……，n，xt表示第t个指标值，xmin表示第t个指标的最小值，xmax表示第t个指标的最大值。

2 结果与分析

2.1 贮藏温度和包装条件对伊犁绢蒿种子萌发效应

贮藏温度、包装条件对伊犁绢蒿种子的千粒重、含水率、胚芽长、可溶性糖、盆栽出苗率以及盆栽幼苗干重有极显著影响(P<0.01)，对发芽率、发芽势、发芽指数无显著影响；胚根长、相对电导率仅在不同贮藏温度间表现极显著差异(P<0.01)；而包装条件显著影响幼苗干重(P<0.05)。两者互作显著影响发芽率、含水率、胚芽长、可溶性糖、盆栽出苗率以及盆栽幼苗干重(表1)。

表1 贮藏温度和包装条件对伊犁绢蒿种子萌发的主效应和交互作用分析

2.2 种子含水率和千粒重

不同贮藏方式间伊犁绢蒿种子含水率存在显著差异(P<0.05)，其中CZ种子含水率最高，为5.33%，比其他处理高26.90%～142.27%，而N最低，仅为2.20%。真空贮藏显著高于非真空贮藏，低温显著高于常温(图1-A)。千粒重FZ(172.00 mg)、F(163.66 mg)间差异不显著，显著高于NZ(132.67 mg)、N(128.67 mg)、C(145.00 mg)，且低温储藏显著高于常温贮藏，零下低温贮藏显著高于零上低温贮藏(图1-B)。

2.3 发芽率、发芽势及发芽指数

C、F、NZ、CZ、FZ间伊犁绢蒿种子发芽率差异不显著，为85.0%～87.8%，且C、F、NZ显著高于N(P<0.05)(图2-A)，而发芽势(图2-B)、发芽指数(图2-C)各处理间差异不显著(P>0.05)，其值分别为51.0%～68.5%、6.7～8.3。

图1 不同贮藏方式下伊犁绢蒿种子的含水率及千粒重Fig.1 Seed water content and 1000-grain weight of S.transiliense

图2 不同贮藏方式下伊犁绢蒿种子萌发指标Fig.2 Seed germination indexes of S.transiliense

2.4 胚根长、胚芽长及幼苗干重

伊犁绢蒿种子胚根长N、NZ显著高于其他4种处理34.57%～233.33%，且C(12.84 mm)、CZ(10.48 mm)较F、FZ显著提高 46.86%～122.38%(图3-A)。胚芽长FZ(13.21 mm)、CZ(11.09 mm)相对较高，显著高于其他4种处理47.88%～56.25%，且低温贮藏显著高于常温贮藏，真空贮藏显著高于非真空贮藏(图3-B)。幼苗干重FZ、CZ、NZ、N、C间差异不显著(P>0.05)，而F显著低于CZ、FZ(P<0.05)(图3-C)。

2.5 可溶性糖及相对电导率

伊犁绢蒿种子可溶性糖含量FZ、CZ较N、C、F、NZ显著增加34.27%～56.18%，而F、NZ则显著高于N、C 6.31%～16.32%(P<0.05)(图4-A)。相对电导率N、NZ显著高于C、CZ、F、FZ(P<0.05)，且C、CZ、F、FZ间差异不显著(图4-B)。总体表明，低温贮藏下种子相对电导率显著低于常温贮藏(图4-B)，而可溶性糖含量则真空处理显著高于非真空处理(图4-A)。

图3 不同贮藏方式下伊犁绢蒿种子胚根长、胚根长、幼苗干重Fig.3 Radical length，germ lengthand seedling dry weight of S.transiliense

2.6 综合评价

为避免各测试指标间相互干扰，通过主成分分析将测定的10个指标合成3个新的综合因子，累计贡献率为79.31%(表2)，其中第一主成分(Ⅰ)中胚芽长、可溶性糖的因子负荷均在0.9以上，可以理解为种子萌发后生长的健壮程度；第二主成分(Ⅱ)中发芽势、发芽指数的因子负荷均在0.8以上，可理解为种子萌发速度；第三主成分(Ⅲ)中发芽率的因子负荷最高，可理解为种子发芽状况。以新合成的3个变量Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ为指标进行隶属函数综合评价(表3)表明，FZ、CZ、NZ处理效果明显优于F、C、N。

2.7 盆栽验证

盆栽条件下伊犁绢蒿种子出苗率FZ最高，为41.0%，显著高于其他处理28.13%～115.78%，F、CZ 较N、C、NZ 显著提高 39.13%～68.42%，而N、C、NZ间无显著差异(图5-A)。FZ、CZ处理伊犁绢蒿幼苗干重显著高于其他处理23.26%～71.03%，且NZ较N、C显著提高 30.36%～55.72%(图5-B)。

表2 伊犁绢蒿种子各综合指标因子负荷量及贡献率

表3 不同贮藏方式下伊犁绢蒿种子活力特征的综合评价

3 讨论

与收获初期相比，常温贮藏6个月后伊犁绢蒿种子发芽率、含水率、千粒重、可溶性糖均出现降低，降幅依次为6.25%、72.84%、28.28%、40.72%，而相对电导率则增加68.19%，表明常温贮藏引起伊犁绢蒿种子活力的丧失，需要寻找适宜贮藏方式来缓解种子的活力丧失速度，这与刘雄盛等[24]的研究结果相一致。伊犁绢蒿种子在零上、零下低温及真空贮藏下其千粒重、含水率、可溶性糖含量等指标与收获初期比降低幅度相对较小，为3.91%～34.57%，相对电导率增加幅度较低，为55.66%。这可能是由于种子在不同贮藏环境下的呼吸方式不同，真空条件下种子只能进行无氧呼吸，非真空条件下种子可以进行无氧呼吸及有氧呼吸，且低温下呼吸相对缓慢，导致其营养物质消耗存在差异[25]，这也为筛选适宜贮藏方式减缓种子活力丧失提供了依据。

图5 盆栽条件下不同贮藏方式伊犁绢蒿种子出苗率及幼苗的干重Fig.5 Seedling percentage and seedling weight of S.transiliense under potting condition

对发芽率、发芽势、发芽指数而言，王桔红等[26]指出，室温贮藏和短期低温贮藏间旱生灌木种子最终发芽率基本相同，张凤[27]也认为，低温(-20～4 ℃)贮藏不能显著改变大豆种子发芽率、发芽势，但王泽等[28]则指出，低温(-18～4 ℃)贮藏下梭梭种子发芽率、发芽势、发芽指数及胚鲜重均显著高于常温贮藏。本研究发现，低温促进了伊犁绢蒿种子的发芽率，但真空与低温组合后这种促进作用消失，而对于常温贮藏的种子经真空处理后，其发芽率也得到明显提高，贮藏方式对发芽势、发芽指数影响不显著。这可能是由于贮藏温度与包装条件间的相互叠加引起种子体内生理生化响应的相互抵消而引起，但其具体原因还有待于进一步研究。

研究表明[29]，真空低温处理白菜种子的胚芽长和幼苗干重高于非真空处理，在常温低湿处理下的烤烟(FluecuredTobacco)，种子萌发后的胚根长度与新采收种子无显著差异[30]，而室温贮藏的大豆种子幼苗干重会随含水量的下降呈现下降趋势[31]。本研究发现，常温及真空常温贮藏比低温及真空低温贮藏显著促进了伊犁绢蒿种子萌发后胚芽的伸长，抑制了胚根的增长，而对幼苗干重影响不显著，这可能是由于种子在萌发过程中，真空减少了种子呼吸能量消耗，低温处理下种子细胞酶的活性受到抑制，从而使种子体内能量保留相对较多[31]，同时由于种子在萌发时是胚芽首先突破种皮，种子体内的营养物质首先会维持胚芽的生长，从而抑制胚根的生长[32-33]；而幼苗干重在各处理之间不显著可能与种子贮藏时间相对较短有关，因此还需进一步研究。

种子在贮藏过程中，相对电导率与种子活力呈现负相关，种子活力强，萌动时细胞修复受损能力强，种子浸出液的电导率低，反之则电导率高[34]。张俊等[35]研究发现低温、真空贮藏条件下种子相对电导率明显低于室温贮藏，且可溶性糖含量显著增加。本研究表明，低温、真空贮藏下伊犁绢蒿种子相对电导率显著降低，而可溶性糖含量则显著增加，这与前人研究[34-35]基本一致。可能是由于种子在贮藏过程中其体内的可溶性糖可以增加细胞质的浓度及质量，可以降低种子的生理活动速率[36]，从而使种子可溶性糖含量消耗和相对电导率增加减慢，最终缓解种子的老化。

盆栽条件下真空零下低温贮藏、零下低温贮藏、零上低温贮藏的伊犁绢蒿出苗率显著高于室温贮藏、零上低温贮藏、室温真空贮藏，且盆栽出苗率远低于纸上发芽率，这可能一方面与萌发种子体内贮藏能量的多少决定幼苗的生长状态相关[37]，低温、真空下伊犁绢蒿种子体内可溶性糖含量显著高于常温、非真空条件；另一方面可能是由于自然环境下种子出苗不仅取决于其体内的营养物质的积累状况，还与其生长环境条件存在一定关系[38]。与纸上发芽所处适宜生长条件相比，盆栽试验条件下伊犁绢蒿种子萌发所处室温环境及土壤中的不确定因素均会对其种子萌发出苗产生负面影响，进而导致其出苗率降低[39]。盆栽真空贮藏下伊犁绢蒿幼苗重显著高于非真空处理，且以真空零上低温贮藏最好，其次为零上低温贮藏。可能是由于真空贮藏降低了种子部分生理活动，使其体内可溶性糖含量保留相对较多[40]，细胞膜受损程度降低，引起种子萌发后幼苗生长较为旺盛。

主成分分析可以利用测试指标间内在联系，通过降维减少其信息的重叠，隶属函数分析可以消除单一指标评价产生的片面性，使评价结果更为客观准确，与实际较为接近[41]。本研究发现，纸上发芽条件下真空贮藏的伊犁绢蒿种子活力明显优于非真空贮藏，而低温贮藏明显高于常温储藏，这与本研究的盆栽试验结果基本吻合。

4 结论

6个月存贮时间下真空、低温贮藏均可延缓伊犁绢蒿种子千粒重、含水率、可溶性糖含量的降低，阻碍细胞膜透性的增加，延长了种子萌发活力。6种贮藏方式下，伊犁绢蒿种子以真空零上和零下低温为最佳贮藏方式。