非洲猪瘟病毒A151R蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及鉴定

李鹏昊，刘 鹏，吴 芃，梁严予，关 洋，李向东，逄文强，田克恭

（国家兽用药品工程技术研究中心，洛阳 471003）

非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）是一种高致病性传染病病毒，临床感染后死亡率高达100%，我国首例ASFV感染于2018年8月3日在沈阳确诊，此后全国多个地区相继报道有ASFV感染病例出现[1]。ASFV感染临床症状表现为高热、网状内皮系统出血、脾脏肿大等，其扩散多以蜱虫和感染猪为媒介[2]，对中国养猪业造成了巨大的经济损失，目前尚无有效预防ASFV的商品化疫苗。

ASFV是一种双链DNA分子病毒，呈二十面体对称结构，基因组长为170～190 kb，编码150～200种蛋白质[3]，主要包括p72、p30、p54和p49等结构蛋白，参与ASFV转录与RNA修饰的pB962L、pD205R和pEP424R等非结构蛋白，以及一些功能未知的蛋白如pA151R、pEP84R和pK421R等[4]。其中，一些在ASFV的感染以及宿主的免疫防护过程中发挥重要功能作用的蛋白， 常被作为ASFV临床诊断及疫苗研究的靶标。吴竟等[5]表达了ASFV的p30基因，并建立了间接ELISA抗体检测方法，用于ASFV的临床诊断；在减毒活疫苗研究方面，研究表明，BA71毒株缺失CD2v基因，可以对亲本毒株提供较好的攻毒保护，且对不同基因型的Georgia 2007/1毒株达到了100%的交叉保护效果[6]；在ASFV亚单位疫苗研究方面，有研究者将p30、p54、p72和p22等蛋白采用“鸡尾酒”式混合免疫，能够产生较高的中和抗体水平，但攻毒不保护[7]。

目前已有较多的ASFV功能蛋白被表达鉴定，并进行了相关功能的研究，但也有部分蛋白未有相关研究报道。本研究首次将ASFV的A151R蛋白在大肠杆菌中进行原核表达，通过添加分子伴侣的方式，实现了目的蛋白的可溶性表达；蛋白纯化后通过Western blot对其大小及反应性进行了鉴定。该研究为ASFV相关ELISA抗体检测试剂盒的研制提供了较好的可溶性抗原，同时也可为ASFV亚单位疫苗的研究提供潜在的候选蛋白

1 材料与方法

1.1 试验材料 大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）感受态细胞、质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；pG-Tf2载体购自宝日医生物技术（北京）有限公司；pET28a载体由本实验室保藏；引物及基因序列合成与测序均由苏州金唯智生物科技有限公司完成；2×TransStart FastPfu PCR SuperMix(-dye)高保真DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司；T4 DNA连接酶和限制性内切酶购自赛默飞世尔科技公司；ASFV阳性参考血清购自欧洲非洲猪瘟参考实验室；HRP标记的羊抗猪IgG购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。

1.2 表达载体的构建 根据ASFV SY18株A151R基因序列设计PCR引物，A151R-F序列为：5'-GGGA ATTCCATATGATGATGGCGTTGTTACACAA-3'（包含NdeⅠ酶切位点），A151R-R序列为：5'-CC GCTCGAGTTATTGGAATATATTGGGCG-3'（包含XhoⅠ酶切位点）；以合成A151R基因序列为模板，使用引物组F/R扩增目的基因片段，PCR反应程序为：95℃变性20 s，56℃退火20 s，72℃延伸30 s，共35个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶回收后与pET28a载体一同由NdeⅠ和XhoⅠ限制性内切酶37℃酶切1 h，胶回收产物由T4 DNA连接酶在室温下连接1 h，然后转化DH5α感受态细胞；提取重组质粒，酶切验证正确后，进行测序鉴定。

1.3 目的蛋白的表达 表达载体验证正确后转化BL21（DE3）感受态细胞（包含pG-Tf2载体），挑取单克隆用于摇瓶发酵。摇瓶发酵条件如下：种子液按1%接种量接种至LB液体培养基（添加终浓度为50 µg/mL的卡那霉素），37℃、220 rpm培养至OD600为0.6左右，添加20 ng/mL的四环素诱导伴侣分子表达，培养2 h后温度降为28℃，并添加终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导目的蛋白表达，诱导时长为12 h（未诱导组不添加IPTG）。收集菌体沉淀，使用缓冲液A（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris，pH7.0）按1∶20的体积比进行重悬破碎，4℃、13 000 ×g离心10 min分离上清液、沉淀（用原倍体积的上述缓冲液重悬）。通过SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况，并利用Image-Pro Plus软件进行量化分析。

1.4 目的蛋白的纯化和鉴定 菌体破碎并离心后的上清液，经0.45 µm过滤后采用蛋白层析纯化系统进行蛋白亲和层析纯化。层析介质为Ni Sepharose 6 Fast Flow，柱流速每分钟1 mL，缓冲液A用于层析柱的平衡；缓冲液A添加50 mmol/L咪唑用于洗脱杂蛋白，添加0.5 mol/L咪唑用于洗脱目的蛋白；蛋白洗脱产物收集后进行SDS-PAGE检测，并利用Image-Pro Plus软件进行量化分析。纯化所得蛋白Western blot条件如下：电压25 V，电流2.5 mA，转膜时间10 min；以稀释1000倍的ASFV阳性血清和阴性血清作为一抗，以稀释2000倍的HRP标记的兔抗猪IgG作为二抗。

2 结果

2.1 表达载体的构建 以ASFV SY18株来源密码子优化后的A151R基因序列为模板，使用引物组A151R-F/R对目的基因进行PCR扩增，得到大小为453 bp的基因片段（图1A）。使用NdeⅠ和XhoⅠ酶同时对目的片段和pET28a载体进行双酶切，酶切产物连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。提取转化子质粒，并用NdeⅠ和XhoⅠ酶进行双酶切鉴定，结果可得到大小分别为5360 bp和453 bp的基因片段（图1B）。将酶切验证正确的载体进行测序，进一步验证其正确性（测序结果未显示）。

图1 A151R基因的PCR扩增及酶切验证Fig.1 PCR amplification of A151R gene and endonuclease digestion

2.2 目的蛋白的表达与纯化 验证正确的重组载体转化包含pG-Tf2载体的大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，转化子进行摇瓶发酵考察目的蛋白的表达，对照组不添加IPTG诱导。SDS-PAGE结果表明，与未诱导组相比，诱导组菌体破碎液有明显的A151R蛋白条带，蛋白大小为17 kDa，诱导组分离上清液中有明显的目的蛋白条带，而沉淀中较少（图2）。Image-Pro Plus软件分析结果表明A151R蛋白65.4%为可溶性表达（图2）；A151R蛋白采用亲和层析纯化后可得到较为单一的目的条带，软件分析结果显示纯化所得A151R蛋白纯度达到97.4%（图2）。

图2 A151R蛋白表达SDS-PAGE结果Fig.2 SDS-PAGE results of A151R protein expression

2.2 A151R蛋白的Western blot鉴定 A151R蛋白纯化后与诱导组分离上清液一同进行Western blot鉴定，使用空载体（不含目的基因片段）转化BL21（DE3）的菌体破碎液作为阴性对照，鉴定结果如图3中所示。诱导组菌体破碎液分离上清液及A151R蛋白纯化样品均可鉴定出大小为17 kDa的条带，与SDS-PAGE所显示目的蛋白条带大小一致，确定鉴定出的蛋白为A151R；阴性对照组未显示出任何条带，表明A151R蛋白可与ASFV阳性血清产生较好的特异性反应。

3 讨论

ASFV是一种烈性传染病病毒，感染后猪群中扩散速度快，感染猪死亡率几乎为100%，然而目前其防控主要依靠疫病监测、消毒等手段来进行[8]。快速高效的诊断方法对ASFV在临床上的及时检出至关重要，以实现感染或阳性猪的快速处理，防止病毒扩散[9]。研究表明，ASFV结构蛋白p12、p30、p54和p72等可诱导宿主细胞产生较高的中和抗体，具有良好的反应原性，可作为ASFV诊断的靶标[10-11]。此外，Lokhandwala等[12]以腺病毒为载体分别表达A151R、B119L、B602L、EP402RΔPRR、B438L、K205R和A104R七种抗原蛋白，并以“鸡尾酒”方式混合免疫，可诱导细胞产生较高的IgG抗体水平和强烈的IFN-γ+型细胞免疫反应。ASFV的其他一些功能未知的蛋白鲜有报道，亟待进行进一步的挖掘研究。本研究以大肠杆菌作为宿主对A151R蛋白进行了可溶性表达（图2），Western blot结果显示ASFV阳性血清可与其产生较好的特异性反应（图3），表明本研究表达的A151R可溶性抗原蛋白，具有较好的反应原性。

图3 A151R蛋白Western blot鉴定结果Fig.3 Western blot identification of A151R protein

ASFV免疫防控难度较大，使用不同系统来源的ASFV结构蛋白如CD2v、p30、p72或p54等制备亚单位疫苗，虽然部分组合方式可产生较高的中和抗体，但保护效果均不太理想且不同毒株之间试验结果差异较大[13-14]。关于ASFV灭活疫苗，即使在添加佐剂之后也很难达到较为理想的保护效果[15]；部分ASFV基因缺失疫苗具有一定的保护效果，但田间使用风险较大，因此实现商品化难度较大[16-17]。复制缺陷型疫苗是近年来倍受关注的新型疫苗研制方法，有研究者以BA71V的A151R和p72蛋白为靶点进行RNA干扰，结果BA71V在Vero细胞中的复制及滴度水平显著降低[18]，表明A151R蛋白的功能可能与ASFV的复制有关，但具体作用机制尚不明确。本研究首次实现了A151R蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达，为ASFV相关诊断试剂及疫苗的研究奠定了一定的基础。