河西走廊区域牛、羊和蜱的嗜吞噬细胞无形体分子检测

孙 明 ，聂 英 ，王淑芳 ，马 超 ，赵 鑫 ，刘玉秀 ，张翠花 ，赵 燕 ，姜金玲 ，张 伟，赵生贤

（1.民勤县畜牧兽医工作站，武威 733000；2.天祝县动物疫病预防控制中心，武威 733000；3.酒泉市动物疫病预防控制中心，酒泉 735000）

嗜吞噬细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum）是一种呈球状多型性的革兰氏阴性专性细胞内寄生菌，引起绵羊、山羊、牛、马、狗、人粒细胞无形体病，临床以表现发热伴白细胞、血小板减少和多脏器功能损害为主[1-2]。1986年，该病被首次报道时曾被命名为HME，1994年报道时另命名为HGA（human granulocytic anaplasmosis），现已证实两类疾病为同一病原体感染，统一为人类无形体病。我国于1999年报告了首例无形体病例，血清学和PCR等检测方法证实，我国新疆维吾尔自治区、内蒙古自治区、黑龙江省、广东省、广西壮族自治区、福建省、云南省、安徽省、东北大兴安岭等地区均有无形体病感染[3-4]。Zhang等[5]通过间接免疫荧光检查流调认为嗜吞噬细胞无形体在我国东南（福建省）和中部地区（山西省）存在很高的感染率，其贮藏宿主包括白足鼠（Peromyscus leucopus）等野鼠和其他动物。在欧洲已经证实美洲钝眼蜱（Amblyomma americanum）、篦子硬蜱（Ixodes ricinus）、肩突硬蜱（I. scapularis）和变异革蜱（Dermacentorvariabilis）是美国无形体病的主要传播媒介，红鹿、牛、山羊均可持续感染嗜吞噬细胞无形体。龟形钝眼蜱（A. testudinarium）、越原血蜱（Haemaphysalisyeni）、嗜群血蜱（H.concinna）、全钩硬蜱（I. persulcatus）、卵形硬蜱（I. ovatus）、微小牛蜱（Boophilus microplus）、森林革蜱（D.silvarum）和草原革蜱（D. verticalis）是中国无形体病的传播媒介[6]。本研究借助于分子生物学技术手段，在河西走廊区域媒介蜱虫及其贮藏宿主中开展动物噬吞噬细胞无形体的监测，并调查蜱虫传播媒介及其贮藏在宿主体内的嗜吞噬细胞无形体流行情况，评估其对公共卫生健康的危害，旨在提高农牧民对蜱及蜱媒病危害和防控的认识，研究结果将可为相关部门加强蜱媒病的研究和制定有效防控措施提供依据，助力畜牧产业扶贫，提高畜产品质量安全，为促进畜牧业的绿色高效发展提供有力支撑。

1 材料与方法

1.1 菌株、载体与试剂 购自宝生物工程（大连）有限公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自宝生物工程（大连）有限公司；ExTaq、RNase-free Water、X-gal和IPTG购自Promega公司；pGEM-T Easy载体购自TaKaRa公司；DNA提取试剂盒购自QIANGEN公司；凝胶DNA提取试剂盒购自Thermo公司；质粒提取试剂盒购自天根生化（北京）科技有限公司。

1.2 基因组DNA 临床样品为2020年采自河西走廊五市部分县区牛、羊反刍动物的抗凝血样品123份，环境蜱虫样品357份。蜱虫样品使用75%酒精充分清洗体表携带的污物后沥干，经少许液氮充分研磨后，用基因组提取试剂盒提取蜱组织和牛羊抗凝血样品基因组DNA，置于-20℃备用。嗜吞噬细胞无形体病原阳性基因组、阴性基因组DNA由中国农业科学院兰州兽医研究所外寄生虫与虫媒疫病团队提供。

1.3 引物的设计与合成 参考文献[7]，设计合成动物嗜吞噬细胞无形体病巢式PCR通用引物2对（表1），由西安擎科生物技术有限公司合成。

表1 用于检测动物嗜吞噬细胞无形体的引物对Table 1 Oligonucleotide primers used for detection of A. phagocutophilum

1.4 动物嗜吞噬细胞无形体病16S rRNA基因的PCR扩增 以动物嗜吞噬细胞无形体病基因组为阳性对照，阴性基因组和PCR用水为阴性和空白对照，以提取的蜱组织和牛羊抗凝血样品基因组DNA为模板进行巢氏PCR第1轮扩增：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，TaqDNA聚合酶1.25 U，EC9和EC12a引物（10 μmol/L）各1 μL，基因组模板1 μL，PCR用ddH2O补足至反应体系为25 μL。运行程序为：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，共循环35次；72℃延伸10 min，4℃保存。以扩增产物为模板，用SSAP2f和SSAP2r引物对进行巢氏PCR第2轮扩增，反应体系同上。运行程序为：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环35次；72℃延伸5 min，4℃保存。扩增程序结束后，对PCR产物进行电泳分析，用1.5%的琼脂糖凝胶（含8 μL/100 mL的Goldview I 型核酸染色剂）电泳在641 bp位置处出现特异性条带时，判定为病原阳性样品。对获得的阳性条带胶回收后连接pGEM-T Easy载体，转染到DH5α感受态细胞，LB平板筛选阳性菌落。鉴定为阳性的重组质粒送西安擎科生物技术有限公司进行测序，经Blastn分析，鉴定扩增片段的正确性。

1.5 序列分析 利用DNAStar工具和MEGA v.6.06软件中的Clustal W程序，对嗜吞噬细胞无形体16S rRNA基因序列进行比对分析，MEGA v.6.06软件构建系统发育进化树（Bootstrap，1000次重复），将获得的16S rRNA基因序列提交到GenBank，获得基因序列登录号。

2 结果与讨论

2.1 抗凝血样品中动物嗜吞噬细胞无形体感染情况 采用巢氏PCR检测方法对河西走廊区域4个市州的123份牛羊血液样品进行了调查，详细信息参照表2，经巢氏PCR扩增和测序鉴定，检出动物嗜吞噬细胞无形体阳性样品4份，阳性样品均来自于武威市天祝县牧区采集的牦牛血样，感染率为4.60%，其余地区未检出阳性样品。而2009年李雁等[8]在甘肃省中部地区（临潭县）采集的青海血蜱样品中检出嗜吞噬细胞无形体阳性率为20%（27/135）。由于笔者在蜱虫样品采集时，蜱虫仍寄生于宿主体表，蜱虫多为半饱血状态，对于病原真实的阳性感染情况应须与宿主抗凝血样品同步检测才能明确，特别是宿主与蜱虫间病原携带和感染致病的机制还需进一步深入的野外调查及实验室研究。通过此次调查分析，笔者等采集的蜱虫样品病原阳性检出率低的可能原因是近十年来农牧民饲养方式的改变，大规模化学杀虫剂的交替使用，特别是河西走廊区域农牧民已将传统的畜牧业放牧方式向大规模舍施饲养方式的转变，降低宿主接触环境中蜱虫的几率。

表2 PCR检测牛羊血液样本中感染嗜吞噬细胞无形体情况Table 2 Detection of A. phagocytophilum in bovine and sheep blood samples by PCR

2.2 蜱样品中动物嗜吞噬细胞无形体感染情况 在牛羊体表和环境中共采集蜱虫924份，牛羊体表寄生蜱虫除波斯锐缘蜱外，其余蜱虫均有感染，亚洲璃眼蜱占75.65%（699/924）、草原革蜱占10.17%（94/924）、波斯锐缘蜱占6.28%（58/924）、森林革蜱占4.65%（43/924）、长角血蜱占1.62%（15/924）、青海血蜱占1.62%（15/924）。检测蜱样品357份，详细信息参照表3，涉及硬蜱科的3个属和软蜱科的1个属。经巢氏PCR扩增测序鉴定，检出动物嗜吞噬细胞无形体阳性样品24份，河西走廊各个市州均有检出，感染率为4.76%～12.5%，平均感染率为6.72%，阳性样品来源于亚洲璃眼蜱、波斯锐缘蜱和草原革蜱3个蜱种，其余蜱种中未检出阳性样品。据文献报道[6,9]，国内学者已在龟形钝眼蜱、越原血蜱、嗜群血蜱、长角血蜱（H. longicornis）、卵形硬蜱、全沟硬蜱、微小牛蜱、森林革蜱和草原革蜱等蜱虫体内检测到嗜吞噬细胞无形体DNA的存在，此次调查，在亚洲璃眼蜱（Hyalomma asisticum asisticum）和波斯锐缘蜱（Argas persicus）体内也检测到嗜吞噬细胞无形体DNA的存在。亚洲璃眼蜱作为西部地区的的优势蜱虫，作为嗜吞噬细胞无形体的贮藏宿主，这与文献报道的结果一致。而波斯锐缘蜱作为软蜱属的成员，可传播锥虫病，是炭疽、麻疯病、鸡螺旋体病原体的带菌者[10]，未见有关报道可传播嗜吞噬细胞无形体。为此，针对软蜱传播无形体病的传播机制研究十分必要。媒介蜱虫的跨地理区域活动为病原的传播提供便利，特别是放牧牛羊在自然环境中接触媒介蜱虫的几率很高，这不得不引起养殖户和兽医工作者的重视。

表3 PCR检测蜱虫样本中感染嗜吞噬细胞无形体情况Table 3 Detection of A. phagocytophilum in tick samples by PCR

2.3 序列分析 将测序鉴定的23株嗜吞噬细胞无形体病原16S rRNA基因序列提交到GenBank，获得基因序列登录号MW397016-MW397038。从构建的进化树可知（图1），分离到的嗜吞噬细胞无形体病原分为2大分支，基因型复杂多变，既有独特的甘肃地方株分布，也有与国内外株分型相近的菌株，特别是从牦牛血液中分离的菌株（MW397035、MW397036和MW397038）和从来源于武威市民勤县采集的亚洲璃眼蜱虫上分离得到的菌株（MW397016、MW397017和MW397018）与中国吉林，土耳其和日本分离的菌株有高的同源性。结果表明，不同地域亲缘关系较近菌株的大量出现，很有可能是由于媒介蜱或者活畜或动物的跨境迁徙、畜产品的跨区域调运而造成的一种病原输入现象。

图1 基于嗜吞噬细胞无形体16S rRNA核苷酸序列的系统发育关系的相邻连接树Fig.1 Neighbour-joining tree showing the phylogenetic relationships of the 16S rRNA based on nucleotide

无形体病，旧称边虫病。病原有6种，分别是嗜吞噬细胞无形体（A. phagocytophilum）、边缘无形体（A. Marginale）、牛无形体（A. bovis）、中心无形体（A. centrale）、绵羊无形体（A. ovis）和山羊无形体（A. capra）[11-12]。1990年首例人感染病例被发现，两年后嗜吞噬细胞无形体被确认为动物致病源，30年间全球多个地区各国家人发病率锐增[1]。1997年，已证实东北和西北的蜱虫、啮齿动物及牛羊等家畜中均有嗜吞噬细胞无形体病原的存在，包括黑龙江省、吉林省、新疆维吾尔自治区、内蒙古自治区等省份[13-16]。2009年，Zhan等[13]从黑线姬鼠（Apodemus agrarius）和啮齿动物上分离出三株嗜吞噬细胞无形体菌株。本次调查表明甘肃省河西走廊区域存在嗜吞噬细胞无形体的低度感染，特别是从媒介蜱体内及其贮藏宿主血液中均有检出。由于媒介蜱的生活周期包括卵、幼虫、若虫和成虫等几个阶段，多种病原伴随着蜱的不同发育阶段来繁衍生存，加之，我国各地生境复杂，蜱种丰富，宿主多样，给病原体提供了一个稳定的生存环境，多省已演化为蜱媒病的重要自然疫源地。嗜吞噬细胞无形体作为蜱传播的人兽共患病之一，不仅制约着畜牧业的较快持续发展，也给公共卫生健康和人畜安全带来了严重威胁，给蜱媒病的监测、防控和治疗带来种种困难。此次针对嗜吞噬细胞无形体监测和流调工作，这也是甘肃省内动物疫控系统首次对辖区内的无形体病进行的一次专项监测，意义非凡。为此，参考取得的相关数据，在河西走廊区域进一步开展人群的嗜吞噬细胞无形体病监测及分子流行病学研究十分必要。