基于萘酰亚胺的H2S可视化荧光探针构建

龚 亮 徐 琳 单秀芝 瞿 杰 胡婉婧 汤建新 汤 力

湖南工业大学 生命科学与化学学院 湖南 株洲 412007

1 研究背景

硫化氢（H2S）是一种无色、易燃、有恶臭的有毒气体，具有溶脂性。人体长时间接触H2S会造成眼睛和呼吸系统损伤，过量摄入会导致呼吸困难、心脏骤停，严重者甚至会死亡[1-2]。同时，H2S也是一种重要的内源性气体信号分子，可通过体内多种生理过程产生。在生理浓度范围内，H2S在心脏保护、神经调节、血管舒张等许多生理过程中发挥重要作用，但一旦浓度超出生理水平，会导致多种疾病，如肝硬化、老年痴呆、胃黏膜损伤等[3-4]。因此，快速、便捷、准确地检测环境和生物体内H2S的浓度具有重要意义。

传统检测H2S的方法主要有分光光度法、电化学测定法、液相色谱法、气相色谱法等[5-15]。虽然这些方法能检测出环境和血液中的H2S含量，但是测试前需要对样品进行预处理，且耗时较长，无法快速、实时检测。H2S容易代谢分解，繁琐的测试前处理往往导致检测结果误差较大。荧光分析法具有灵敏度高、响应快速、非破坏性，并可对目标物进行原位实时检测等特点，近年来被广泛用于分析检测领域[16-21]。利用H2S的还原性和亲核性，目前研发人员开发了许多检测H2S的荧光探针，然而，这些荧光探针大多是传统有机小分子荧光探针，存在斯托克斯位移小等缺点，易导致背景干扰大，荧光自吸收高。

1, 8-萘酰亚胺是一种重要的荧光基团，具有光稳定性好、量子产率高、斯托克斯位移大、易于合成及修饰等优点，常被用于模块化合成各类荧光探针[22-25]。本文基于1, 8-萘酰亚胺设计合成了一种新的荧光探针DHBID，其结构及对H2S的响应机理如图1所示。该探针以1, 8-萘酰亚胺基作为荧光基团，2, 4-二硝基苯基作为猝灭基团，在没有H2S存在时，1, 8-萘酰亚胺与2, 4-二硝基苯之间发生了分子内电荷转移（intramolecular charge transfer，ICT），导致1, 8-萘酰亚胺的荧光被2, 4-二硝基苯猝灭，因此该探针自身荧光十分微弱；但与H2S反应后，荧光探针分子内的醚键断裂，荧光基团与猝灭基团脱离，1,8-萘酰亚胺的荧光恢复。该荧光探针可选择性识别H2S，通过荧光从无到有，实现对H2S的“turn-on”定量检测。

图1 DHBID荧光探针的结构及对H2S的响应机理Fig. 1 Structure of fluorescent probe DHBID and its reaction mechanism with H2S

2 实验

2.1 实验试剂与仪器

1）主要试剂

4-溴-1, 8-萘二甲酸酐（4-Bromo-1, 8- naphthalic anhydride，NA，纯度为96%）、乙醇胺（纯度为99%）、2, 4-二硝基氟苯、无水碳酸钾（K2CO3，纯度为99%）、无水硫化钠（Na2S，纯度为95%）、乙醇、N, N-二甲基甲酰胺（N, N-dimethyl-formamide，DMF）、四氢呋喃（tetrahydrofuran，THF），以上试剂均为分析纯，购于阿拉丁试剂有限公司。

2）主要仪器

核磁共振波谱仪，Avance 500型，瑞士Bruker公司；紫外光谱仪，UV3600型，日本岛津公司；荧光分光光度计，LS45/55型，美国PE公司。

2.2 探针的合成

探针DHBID的合成路线如图2所示。由图2可知，反应物4-溴-1, 8-萘二甲酸酐（NA），经两步亲核-消除过程，得到反应中间体1（Br-BN-OH）；之后，在碱性条件下，Br-BN-OH进一步发生取代反应，生成反应中间体2（HO-BN-OH）；最后，HO-BN-OH与2, 4-二硝基氟苯发生取代反应，获得产物荧光探针DHBID，总产率为57.81%。荧光探针DHBID合成过程具体操作如下。

图2 DHBID荧光探针的合成路线Fig. 2 Synthetic routes of fluorescent probe DHBID

2.2.1 化合物Br-BN-OH的合成

称取2.070 g 4-溴-1, 8-萘二甲酸酐（7.5 mmol）、0.579 g 乙醇胺（9.0 mmol）溶于120 mL乙醇中，加热回流4 h。将反应后的混合物进行冰水浴，使产物完全析出，抽滤，用乙醇或丙酮洗涤滤饼3次，真空干燥得到化合物Br-BN-OH。测定其产率为84.54%。1H NMR（DMSO-d6, 300 MHz），化学位移δ（TMS）：8.58～8.69 (q, 2H), 8.42～8.44 (d, 1H),8.04～8.07 (d, 1H), 7.84～7.89 (t, 1H), 4.44～4.47 (t, 2H),3.96～4.01 (d, 2H), 2.25～2.29 (t, 1H)。

2.2.2 化合物HO-BN-OH的合成

称取1.92 g（6.00 mmol）产物Br-BN-OH充分溶解到120 mL DMF中，加入6.00 g （43.48 mmol）碳酸钾，在95 ℃下回流6 h。反应结束后，将蒸馏烧瓶冷却到室温，加入40 mL冷的去离子水，静置，析出橘黄色沉淀。待沉淀完全析出后抽滤，用水洗涤3次，将产物于60 ℃下真空干燥，即得到化合物HO-BN-OH。测定其产率为85.35%。1H NMR（DMSO-d6, 300 MHz），δ（TMS）：8.48～8.53 (t,2H), 8.27～8.30 (d, 1H), 8.16～8.18 (d, 1H), 7.93～7.98 (q,1H), 4.78～4.82 (t, 1H), 4.09～4.11 (d, 2H), 3.57～3.64 (q,2H), 2.5 (s, 1H)。

2.2.3 化合物DHBID的合成

称取1.028 g（4.00 mmol）产物HO-BN-OH充分溶解在20 mL DMF中，加入2.000 g （14.47 mmol）碳酸钾和0.892 g 2, 4-二硝基氟苯，在90 ℃下避光回流6 h。反应结束后，将蒸馏烧瓶放置在黑暗环境中自然冷却到室温，再加入20 mL去离子水使其沉淀析出，快速抽滤、洗涤。然后将产物置于60 ℃干燥机中避光干燥，即得到目标荧光探针DHBID。测定其产率为80.12%。1H NMR（DMSO-d6, 300 MHz），δ（TMS）：8.65～8.66 (d, 1H), 8.54～8.58 (m,2H), 8.45～8.48 (t, 1H), 8.32～8.34 (d, 1H), 8.21～8.23 (d,1H), 8.00～8.02 (d, 1H), 7.63～7.66 (d, 1H), 4.63～4.67 (t,2H), 4.46～4.50 (t, 2H), 2.5 (s, 1H)。

2.3 响应性质测定

2.3.1 光谱分析

配制浓度为10 μmol/L的探针DHBID母液（溶剂为THF）。测定在终浓度为1 μmol/L的探针DHBID溶液中，加入终浓度为1 μmol/L Na2S前后的紫外吸收、荧光发射光谱。

2.3.2 浓度响应曲线

配制浓度为10 μmol/L的探针DHBID溶液（溶剂为THF），以及一系列不同浓度的Na2S溶液（现配现用）。分别将DHBID溶液（终浓度为1 μmol/L）加入不同浓度的Na2S溶液中（终浓度为5, 10, 25, 50,100, 250, 500, 1000 nmol/L）进行反应(实验中采用Na2S作为 H2S供体)，测定反应后溶液的荧光光谱。

2.3.3 温度与时间响应

分别配制浓度为10 μmol/L的探针DHBID溶液a/b/c（溶剂为DMF），和25 nmol/L的Na2S溶液，两者按照体积比1:9混合（总体积为1 mL），将混合溶液分别置于25, 37, 60 ℃的恒温水浴环境中进行反应，连续测定反应一定时间后溶液的荧光光谱，探究温度、时间分别对DHBID荧光探针检测Na2S的响应情况。

2.3.4 选择性试验

3 结果与讨论

3.1 荧光探针的光学性质

探针分子DHBID以1, 8-萘酰亚胺基作为荧光基团，共轭结构的存在使其表现出较强的紫外吸收，2, 4-二硝基苯基作为猝灭基团。在没有H2S存在时，1,8-萘酰亚胺与2, 4-二硝基苯之间发生分子内电荷转移，致使该探针自身荧光十分微弱；当有H2S存在时，荧光基团与猝灭基团脱离，1, 8-萘酰亚胺的荧光恢复。荧光探针DHBID在加入Na2S前后的UV-Vis吸收光谱及荧光发射光谱如图3所示。

图3 加入Na2S前后DHBID的光学性质Fig. 3 Optical properties of DHBID before and after adding Na2S

由图3a可知，DHBID在加入Na2S前后的紫外吸收光谱都在275, 339 nm处呈现吸收带，且在与Na2S反应后，275 nm处吸收有所增强。由图3b可知，DHBID探针分子在加入Na2S之前，体系几乎没有荧光；当加入Na2S后，在480 nm处荧光显著增强。这是因为荧光探针分子内的醚键断裂，荧光基团与猝灭基团脱离，1, 8-萘酰亚胺的荧光恢复，呈“turn on”信号响应变化。

3.2 反应温度与响应时间对荧光探针的影响

温度对化学反应的影响非常明显，且荧光探针DHBID是被用于检测人体内的内源性小分子H2S，因此，本研究首先探讨了温度对荧光探针的活性影响。图4是荧光探针在相同Na2S浓度下，不同温度下（25, 37, 60 ℃）的荧光强度随反应时间的变化曲线。

图4 不同温度和时间下DHBID对H2S响应的荧光变化曲线Fig. 4 Fluorescence curve of DHBID response to H2S at different temperature and time

由图4可以看出，在反应初始阶段，不同温度下DHBID的荧光强度均随时间的增加迅速增强，但增强幅度有所不同。当温度为60 ℃时，反应初期探针的荧光强度增加最快，但反应30 min后，体系的荧光强度增幅较弱，逐渐形成一个比较稳定的平台，这意味着荧光探针与H2S的反应基本完成。当温度为37 ℃时，在60 min内，体系的荧光强度随着时间的增加而增强，之后达到了相对稳定的平台，且荧光强度最大值与60 ℃的最大值几乎吻合。当温度为25 ℃时，在90 min的反应时间内，体系的荧光强度一直随时间的增加而增强，并没有出现稳定的平台，且荧光强度最大值小于37, 60 ℃的最大荧光强度。由此说明，温度对荧光探针的活性影响较大，在较低的温度环境中，荧光探针与Na2S的反应速度较慢。故本研究选取反应温度37 ℃，反应时间60 min作为测试条件。

3.3 荧光探针对Na2S的响应

图5是荧光探针DHBID对不同浓度Na2S的荧光响应光谱图（图5a）及浓度响应曲线（图5b），其中图b的内嵌图为DHBID对低浓度Na2S的线性相关曲线。

图5 DHBID对Na2S浓度的荧光响应光谱及响应曲线Fig. 5 The fluorescence curve of DHBID probe in response to different concentrations of Na2S

如图5可知，在终浓度为10 μmol/L的DHBID探针溶液中，随着Na2S的浓度由0增加到250 nmol/L，溶液中荧光强度显著增强，并在5～100 nmol/L的范围内，探针的荧光强度与Na2S浓度呈现良好的线性关系，拟合回归方程为：Y= 19.258X+319.460，R2= 0.9758。在250～1000 nmol/L范围内，荧光强度增长缓慢，并趋于平衡，表明DHBID与Na2S已基本反应完全，此时信背比达15倍。

同时，根据3σ/k规则，计算出DHBID探针对Na2S浓度的检测下限为2 nmol/L。其中：σ为空白荧光强度标准偏差，k为线性方程斜率。

图6为在365 nm紫外灯（图6a）及白光灯（图6b）照射下，加入不同浓度的Na2S后，溶液体系的荧光及颜色变化。

图6 在紫外灯和白光灯下DHBID对不同浓度Na2S的响应Fig. 6 Visualized detection of Na2S images by DHBID under UV and white light

彩图

由图6可知，随着Na2S浓度的增加，紫外灯下溶液体系的荧光颜色逐渐增强，白光灯下溶液的颜色逐渐由淡黄色变为玫红色；在Na2S浓度达到250 nmol/L后，两种灯光下溶液颜色不再随Na2S浓度的增加而发生明显变化。因此，当Na2S浓度在5～250 nmol/L范围内，DHBID荧光探针可通过颜色变化，对环境中Na2S的浓度实现半定量检测。该检测方法更加直观、方便，无需其它检测仪器与手段辅助。

3.4 探针选择性

探针的选择性是决定探针能否准确检测样品的重要性能。为此，本研究测试了DHBID荧光探针对15种自然界或人体内常见阴离子的选择性，包括（依次编号为1～15），得到15种干扰离子的荧光响应强度及肉眼、紫外灯下荧光响应情况如图7所示。

图7 DHBID对不同潜在干扰离子的响应情况Fig. 7 The response of DHBID probe to different potentially interfering ions

彩图

如图7a所示，向荧光探针体系中加入等浓度的各种干扰阴离子溶液及Na2S溶液，只有加入Na2S溶液后的样品才呈现明显的荧光响应信号，其他阴离子基本上无荧光信号。图7b中在365 nm的紫外灯照射下，只有加入Na2S溶液后的样品呈蓝绿色，其它样品没有荧光响应。同时，通过肉眼可以观察到，只有在加入Na2S溶液后的样品呈玫红色，其它样品依旧无颜色变化。综上所述，该探针对硫化氢具有高度的响应性及选择性，且该探针对硫化氢的检测可实现“裸眼”检测。

4 结论

本研究基于1, 8-萘酰亚胺合成了一种新型荧光探针DHBID，并将其用于H2S检测。该探针合成、提纯步骤简单，并对H2S响应度高。与不同浓度的硫化钠反应后，在5～250 nmol/L范围内，DHBID具有明显的“turn-on”型荧光响应信号，且在5～100 nmol/L的范围内探针荧光强度与Na2S浓度呈现良好的线性关系，检测下限可达2 nmol/L。选择性测试表明，DHBID探针对复杂环境中常见的阴离子无响应信号，因此能对H2S表现出高选择性。此外，在加入不同浓度的硫化钠后，体系的颜色会逐渐由淡黄色变为玫红色，实现对硫化氢浓度的可视化检测。