中药对致犊牛腹泻大肠杆菌体外抑菌效果

杨敩校 ， 唐慕德 ， 和玉丹 ， 郭锦凯 ， 漆 招 ， 梁 琦 ， 刘 犇 ， 郑文亚

(1.宜春学院生命科学与资源环境学院 ， 江西 宜春 336000 ； 2.江西生物科技职业学院动物科学系 ， 江西 南昌 330200)

犊牛腹泻是现今肉牛和奶牛养殖中一种常见的疾病，轻则降低犊牛的生产性能，重则引起犊牛死亡。引发犊牛腹泻的原因较多，如气候变化、饲养管理不善等。在诸多原因中，由大肠杆菌引起的犊牛腹泻应当引起足够的重视[1-4]。大肠杆菌作为肠道正常菌群一般是非致病性的，但是某些血清型却有着较强的致病能力，能感染多种动物，严重时会导致患畜的死亡。经过多年研究证实，产肠毒素大肠杆菌为引发幼畜腹泻的重要原因[5-7]。大肠杆菌血清型众多，不同血清型菌株间缺乏交叉免疫保护，疫苗防治效果不理想。临床上常使用的抗生素也因长时间滥用，导致泛耐药菌株不断增加，治疗效果日趋不理想[8-9]。近年来，越来越多的中药被证实具有抗菌作用，中药作为纯天然物质，具有低成本、使用方便、低毒副作用的特点[10-12]。本试验选取黄连、白头翁、黄芩等24味中药，探究其单味粗提取液对大肠杆菌的体外抑菌效果，以期为犊牛腹泻大肠杆菌病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 中药和试验菌种 黄连、白头翁、黄芩、木香、秦皮、苦参、马齿苋、黄柏、紫花地丁、大青叶、金银花、蒲公英、板蓝根、野菊花、连翘、大黄、地榆、夏枯草、薄荷、广藿香、甘草片、瓜蒌、黄芪、当归，共计24味中药，均购自江西省宜春市袁州区城西金康大药房。试验菌株为分离纯化的致犊牛腹泻大肠杆菌，由宜春学院肉牛(羊)疾病控制实验室提供。

1.2 主要试剂和仪器设备 普通营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、SS琼脂培养基、伊红美蓝培养基、麦康凯琼脂培养基、革兰染色剂和肠杆菌生化反应鉴定试剂等，均购自青岛海博生物技术有限公司。高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱和光学显微镜等，由宜春学院肉牛(羊)疾病控制实验室提供。

1.3 试验方法

1.3.1 中药提取液的制备 24味中药均采用水提取法进行提取、浓缩。每种中药称取40 g，加入蒸馏水400 g浸泡1 h；武火煮沸后转文火煎煮2 h，4层纱布滤取药液；随后取药渣，再加入320 g蒸馏水，武火煮沸后转文火煎煮40 min，用4层纱布滤取药液；合并2次药液，再加热浓缩至40 mL，即为中药提取液。中药浓度为1 g/mL，提取液120 ℃ 20 min高压蒸汽灭菌，冷却后分装到5 mL的灭菌EP管中，贴好标签，4 ℃冰箱冷藏备用。

1.3.2 试验菌株的活化 从冻存管中取出冻存菌株，加入营养肉汤，于37 ℃的恒温摇床中80 r/min的条件下培养12 h，进行菌株复苏。

1.3.3 试验菌株鉴定 用接种环分别挑取数环复苏后的菌液划线接种至SS培养基、麦康凯培养基、伊红美蓝培养基；同时取洁净玻片挑取复苏营养肉汤和上述 3 种培养基上的典型可疑菌落进行涂片、染色、镜检。生化鉴定参照《伯杰细菌鉴定手册》，用接种针挑取复苏后的菌株穿刺接种在三糖铁琼脂培养基中，并接种菌株至葡萄糖、乳糖、纤维二糖、麦芽糖、MR、V-P、尿素、枸橼酸盐、硫化氢、半固体、DNA 酶、苯丙氨酸脱氨酶等微量生化鉴定管中，37 ℃恒温培养36 h，连续观察1周，每个项目重复做2次，观察结果并记录。

1.3.4 菌悬液的配置 鉴定为大肠杆菌后用接种环挑取复苏后的菌液在营养琼脂平板上分区划线，37 ℃恒温培养12 h；用灭菌棉签小心刮取菌落，洗脱至灭菌生理盐水中，采用麦氏比浊法将菌悬液浓度调至1.0×107CFU/mL，4 ℃冰箱保存备用。上述操作均在超净工作台中进行。

1.3.5 体外抑菌试验 采用纸片法进行体外抑菌试验，将直径为6 mm的无菌滤纸圆片完全浸没在各中药提取液中，4 ℃保存24 h。用无菌涂布棒将菌液均匀涂布于琼脂平板上，采用四点法将浸泡好的纸片放于平皿中，每种中药提取液做3个重复；37 ℃恒温培养箱中培养24 h，用游标卡尺十字交叉法测定其抑菌圈直径R，取其平均值表示抑菌圈的大小。药敏结果判读参照张靖飞[13]所用方法，当R≥9 mm为高度敏感，5 mm≤R<9 mm为中度敏感，R<5 mm为不敏感。

1.3.6 最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定 MIC测定采用微量肉汤稀释法，在96孔板上进行；1～12号孔中均加入0.1 mL营养肉汤，在1号孔加入0.1 mL中药液，反复吹打混匀后吸取0.1 mL混合液到第2孔，相同操作至第9孔，吸取第9孔混合液0.1 mL弃去；第10、11孔和第12孔依次加入0.1 mL的菌悬液、营养肉汤和待测中药提取液；在1～12号孔中依次加入10 μL的菌悬液，混匀后于37 ℃恒温培养箱中培养；每种中药做3个重复，最后选择2组试验菌株生长状况最为接近的菌株测定MIC值；以混合液是否变浑浊为标准，判定该中药的MIC值。MBC测定时，从无明显细菌生长的孔中吸取50 μL混合液，均匀涂布于琼脂平板培养基上，放于37 ℃培养箱中培养24 h后观察结果；以培养基上菌落生长数小于3个的药物浓度作为该中药的MBC值[14]。

2 结果

2.1 试验菌株鉴定 形态学鉴定结果如封底图1所示，试验菌株使肉汤培养基变浑浊；在普通琼脂平板生长出表面光滑、边缘整齐、半透明状、部分呈凸起状的菌落；在麦康凯培养基上生长出深扁平、表面光滑、边缘整齐的菌落；在伊红美蓝培养基上呈现浅紫红色、圆形、光滑、带有金属光泽的圆形菌落；在 SS 培养基上菌落形态呈圆形桃红色、边缘整齐、表面光滑；经革兰染色，在油镜下观察试验菌株呈现两端钝圆的红色杆菌，单个或成片状分布。

图1 试验菌株菌落形态和镜检结果

生化鉴定结果如表1所示，肉眼观察三糖铁基底部变黄证明试验菌株产生酸性物质，且底部都有空隙证明其产生气体；菌株生长消耗了一部分葡萄糖、乳糖和麦芽糖；分离菌吲哚和甲基红试验均为阳性，V-P试验均为阴性；枸橼酸盐、纤维二糖和尿素酶试验均为阴性；甘露醇、卫矛醇和山梨醇试验为阳性。生化鉴定结果与大肠杆菌生化特点相符。

表1 试验菌株生化反应结果

2.2 致犊牛腹泻大肠杆菌对24味中药提取液敏感性的测定 结果如表2所示，致犊牛腹泻大肠杆菌对这24味中药敏感性存在一定的差异，对黄芩、地榆表现为高度敏感，抑菌圈直径均大于10 mm，对其他22味中药表现为中度敏感。

表2 致犊牛腹泻大肠杆菌对24味中药提取液的敏感性

2.3 24味中药提取液MIC和MBC的测定 结果如表3所示，24味中药对致犊牛腹泻大肠杆菌的抑菌活性存在差异，黄芩、地榆和金银花的抑菌活性最强，三者的MIC值均为31.3 mg/mL；其次为白头翁、木香、大青叶、连翘、夏枯草、瓜蒌和当归，MIC值均为62.5 mg/mL；其余中药的抑菌活性较低。在试验的24味中药中，马齿苋、大青叶、大黄和地榆的杀菌能力最强，MBC值均为250 mg/mL；其余中药的杀菌能力较低。

表3 24味中药提取物对致犊牛腹泻大肠杆菌MIC和MBC的测定

3 讨论

本试验结果显示，常用的中药(如大黄、黄芩等)对致病性大肠杆菌具有一定的抑制作用。胡安古丽·努尔别克等[15]通过对大黄、黄连和甘草片等11味中药体外抑菌效果的研究发现，黄连、没食子和骆驼蓬子等对大肠杆菌均有一定的抑制作用；周艺等[16]通过对黄连、黄柏、金银花和川芎等25味中药体外抑菌效果的研究发现，黄连、大黄和夏枯草对大肠杆菌均有较强的体外抑制作用；上述研究与本试验结果相类似，但也有不同之处，如周艺的研究中发现黄连、大黄对大肠杆菌的抑菌圈均在20 mm以上，胡安古丽·努尔别克的研究中发现大黄、黄连对大肠杆菌的MIC分别是125 mg/mL和62.5 mg/mL，均高于本试验结果；导致上述差异结果的原因可能是试验菌耐药性、血清型不同，选用中药的产地不一致，也可能是试验方法的差异。

本试验采用琼脂扩散法和微量肉汤稀释法，测定了24味中药的抑菌圈直径、MIC和MBC，结果显示黄芩、地榆等中药对试验大肠杆菌有一定的抑菌效果，马齿苋、大青叶等中药甚至具备一定的杀菌效果，其他中药对试验大肠杆菌有一定的抑制作用。本试验还发现，大肠杆菌对24味中药提取液敏感性情况(即抑菌圈直径大小)与理论上预测的MIC、MBC值大小不一致，导致这种现象的可能原因是某些中药成分理化性质的差异导致在琼脂中难于扩散，所以不能简单凭借抑菌圈直径的大小来判断某种中药对试验菌株是否有作用，还应参考MIC和MBC值测定的情况来综合判断。

中药的抑菌是一个复杂的过程，抗菌作用可通过多个环节起作用，中药抑菌的方式也不尽相同[17-19]。研究表明，中药含有的有效成分(如生物碱、有机酸、黄酮和鞣质等化合物等)可通过影响细菌细胞壁和细胞膜功能直接作用于菌体，如黄芩苷可以通过改变细胞膜的通透性、改变某些基因的表达和影响细胞的呼吸代谢作用等方式，而直接起到抑菌甚至杀菌的作用；中药还可以通过提升机体免疫力、降低细菌毒力或减轻细菌对机体组织细胞破坏作用而起到抗菌作用[20-23]。在认识到中药诸多优点时，也不能对阻碍中药应用发展的问题视而不见：如中药体外试验效果很明显但是动物试验不稳定、不理想；对中药的作用机理不明确；对中药的代谢动力学掌握还不全面；对中药具体有效成分的研究不够深入；在中药与抗生素、抗菌肽、益生菌联合抗菌上研究不够等。这些问题的解决将有助于中药在养殖业上更广泛、更深度的应用[24]。