两例黄金蟒死亡病例的病理诊断分析

田馨媛 陈海良 李 胜 刘天龙*

(1.中国农业大学动物医学院，北京，100193；2.北京绿野晴川动物园有限公司，北京，102602；3.大兴区畜禽繁育改良指导站，北京，102602)

黄金蟒(Pythonbivittatus)也称白化缅甸蟒，属国家二级重点保护野生动物[1]和《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附录Ⅱ限制国际贸易的受保护动物。缅甸蟒作为变温动物，在外界环境温度低于所需最低温度或发生剧烈变化时极易发生消化道和呼吸系统疾病，感染性肺炎是最严重的疾病之一[2]。本研究对2条死亡的圈养黄金蟒进行了病理学检查，在肺脏中分离出1株铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)与1株粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)，对2菌株的耐药情况进行了研究。黄金蟒的死亡原因最终诊断为上述2种细菌引起的化脓性肺炎，希望本研究可以为圈养蛇类的饲养管理、疾病防治和野生蛇类的保护提供参考。

1 材料与方法

1.1 病例背景

病例来自北京野生动物园，其中雌黄金蟒冬眠后，持续状态不佳、精神沉郁，雄黄金蟒后发病，症状相似，后食欲废绝，最终死亡。

1.2 组织病理学检查

对死亡黄金蟒尸体剖检，取主要脏器在4%甲醛溶液中充分固定后，常规方法制作石蜡切片，HE染色，重点观察肺脏、心脏、肝脏、肾脏、脾脏和雌性输卵管的组织病理学变化。

1.3 细菌分离培养与镜检

肺脏、肝脏和肾脏细菌划线培养，用普通营养琼脂37 ℃恒温培养24 h，并使用NB肉汤增菌培养，分离出2种细菌，对分离获得的细菌单菌落进行革兰染色和镜检。

1.4 体外药敏试验(纸片法)

取2种细菌的纯培养物倍比稀释、涂布，选择1×106cfu/mL的细菌悬液，用8种药敏纸片做药物敏感性试验，测量抑菌圈直径，确定2种分离菌株对各种药物的敏感性。

1.5 细菌16S rRNA基因序列测定与同源性比对

将分离到的2菌株纯培养物提供给北京六合华大基因科技有限公司进行基因组DNA提取及16S rRNA基因扩增。PCR扩增引物为27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR扩增反应体系(总体积25 μL)：PCR Mix 21 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL。PCR反应条件：96 ℃预变性5 min；96 ℃变性20 s，62 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃终延伸10 min；4 ℃保存。目标条带大小为1 500 bp左右。PCR产物检测及纯化：取3 μL PCR产物1%琼脂糖凝胶检测，观察条带性状。PCR产物纯化按照磁珠纯化标准流程操作。将纯化后的 PCR 产物上机检测，测序引物分别使用V4-515F(5′-GTGCCAGCAGCCGCGGTAA-3′)和V4-806R(5′-GGACTACCAGGGTATCTAA-3′)，测序结果在NCBI-BLAST中比对。

2 结果与分析

2.1 剖检变化

尸体剖检发现雌黄金蟒泄殖孔流出红色液体，伴有恶臭气味。剥离皮肤后发现胸腹腔壁淤血、坏死(图1A)；打开胸腹腔见肺脏广泛性坏死、化脓，在肺的中央管腔内有柱状脓性分泌物(图1B、C，脓性分泌物如B箭头处所示)；输卵管坏死，化脓严重，可见数枚腐烂卵。

图1 黄金蟒尸体剖检结果Fig.1 Autopsy results of the golden python

2.2 黄金蟒的组织病理学检查

黄金蟒肺脏可见肺泡腔狭窄，肺泡壁增厚，肺泡腔内有粉红色渗出物(图2A)，部分区域可见大量细菌团块(图2B)。一蟒肝脏肝索紊乱，肝细胞广泛性变性、坏死，脂褐素沉着(图2C)，另一蟒肝脏局部出血、肝细胞脂肪变性(图2D)。脾脏红髓与白髓分界不清(图2E)。肾脏可见肾小球毛细血管基膜增厚(图2F)，肾小管上皮细胞变性、坏死、脱落、细胞核溶解，间质增宽见粉红色液体(图2G)。雌蟒输卵管黏膜上皮结构破坏、脱落，黏膜肌层间有大量细菌团块，黏膜下层水肿(图2H)。心肌肿胀、断裂(图2I)。

图2 黄金蟒组织病理学镜检显微图片Fig.2 Histopathological examination results of golden pythons

2.3 分离细菌的培养特征与细胞形态

死亡黄金蟒的肺、肝和肾细菌分离培养结果见图3C-E。结果显示，连续37 ℃恒温培养24 h后，在营养琼脂培养基上出现了2种菌落(菌株A、B)。取肺组织中分离的细菌进一步分离培养，菌株A生长为较大的、扁平、湿润的乳黄色菌落，边缘为波浪形，并可产生绿色色素(图3A)；菌株B生长为较小的乳白色圆形菌落，菌落中央隆起、边缘扁平(图3B)。

图3 黄金蟒各器官内细菌分离培养结果Fig.3 Results of bacterial isolation and culture in various organs of the golden python

对2种细菌进行革兰染色，镜检结果显示，菌株A、B均为红色，即革兰阴性；形态近似，均为短杆状，单个或成对排列。

2.4 体外药敏试验(纸片法)结果

分离到的铜绿假单胞菌菌株对恩诺沙星、氟苯尼考、氯霉素、庆大霉素、新霉素、卡那霉素和多黏菌素B 7种药物完全敏感，对阿奇霉素具有耐药性；分离到的粪产碱杆菌菌株对以上8种药物完全敏感。(表1)。

表1 药敏试验结果

2.5 16S rRNA基因测序与同源性比对

根据北京六合华大基因科技有限公司提供的报告，菌株A和菌株B的16S rRNA序列与NCBI-BLAST的序列进行比对的结果如表2所示，菌株A与铜绿假单胞菌的亲缘关系最接近(99.93%)，菌株B与粪产碱杆菌的亲缘关系最接近(100.00%)，可以判定菌株A为铜绿假单胞菌，菌株B为粪产碱杆菌。

表2 菌株A和菌株B的16S rRNA基因序列同源性比对结果(各摘录报告内前3条结果)

3 讨论

2例黄金蟒的病理学检查结果显示，雌性黄金蟒在难产后，输卵管中的卵发生腐败，引起重化脓性输卵管炎，输卵管结构被破坏，推测病原菌进入血管引发菌血症或脓毒败血症，导致多器官的化脓性炎和化脓灶的产生。2条黄金蟒均出现了化脓性肺炎，肺组织内见大量细菌，肺泡狭窄或充满渗出物，呼吸功能受到严重损害。最终2条黄金蟒因细菌大量代谢产物的毒性作用及呼吸困难死亡。黄金蟒各器官中分离到的铜绿假单胞菌菌落数量较多，致病性相对粪产碱杆菌强，推断2条黄金蟒的死亡主要由铜绿假单胞菌感染引起，粪产碱杆菌在此病例中为继发感染的可能性较大。

铜绿假单胞菌又称绿脓杆菌，是一种革兰阴性、专性需氧的条件致病菌，在环境中广泛存在，也可见于人和多种动物的皮肤、肠道等。铜绿假单胞菌感染可造成各组织器官的感染、脓肿和败血症等，其中化脓性肺炎为较典型的病变[3-7]。粪产碱杆菌也是一种革兰阴性、专性需氧的条件致病菌，在水和土壤中广泛分布，存在于人和多种动物的肠道中[8]。通常，粪产碱杆菌对家兔和小鼠的致病性较弱[9-10]，但在人和动物中也存在由粪产碱杆菌单独感染引起的呼吸系统感染、泌尿系统感染、角膜炎、脓肿和败血症等[11-15]。铜绿假单胞菌与粪产碱杆菌均可感染人或动物引发多种疾病，动物园管理人员应注重环境卫生，定期消毒。接触和治疗患肺炎蛇，以及对怀疑患肺炎死亡的蛇进行剖检时，注意个人防护。繁殖蛇类应通过拍摄X线片等方式检查雌蛇是否难产，若发生难产应及时帮助雌蛇将卵排出或手术取出，以免引发细菌感染。

药敏试验结果表明，北京野生动物园内感染两黄金蟒的铜绿假单胞菌与粪产碱杆菌的耐药情况不明显，在蛇类发生具有类似症状的感染时，可以选择使用相应的敏感药物治疗。