霍山石斛多酚组分提取工艺优化与抗氧化活性研究

邓 辉，刘莉彬，刘庆慧， 黄 征，祝启张，宁克壮，韩邦兴

(1.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012；2.安徽省中药资源保护与持续利用工程实验室，安徽 六安 237012)

《神农本草经》中关于石斛的记载是石斛最早出现的地方[1]，距今有2300多年的历史，而最开始有“石斛出六安”这个说法的是出自西汉的《范子计然》[2]。霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)多藏身于崇山峻岭的悬崖峭壁上，有补五脏虚劳的说法，享有极高的美誉[3]。近现代药理研究表明，霍山石斛具有增强和调节免疫力、预防和治疗白内障、抗氧化、抗肿瘤等多种功效[4]。但是目前对霍山石斛的研究还是以多糖和生物碱等为主，而对其多酚的提取和抗氧化活性的研究还并没有出现太多的报道。前人研究表明，植物多酚具有良好的应用价值尤其是在抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等方面[5]。这些结果的出现充分说明了人们对总多酚组分研究和应用的重视。

多酚的提取方法包含溶剂萃取、超声波提取、微波提取法和超临界流体提取等方法[6]。由于被提取的组分分子的极性和理化性质存在差异，溶剂法提取动植物体内的活性成分，用相似相溶的原理来选择溶剂类型，并且利用该性质来获取动植物体内的活性成分。本次实验采用溶剂萃取法进行提取霍山石斛茎干中的总多酚组分，同时研究它的抗氧化活性，为今后霍山石斛的开发与利用提供相应的理论支持。

1 材料

1.1 仪器设备

表1 仪器设备

1.2 材料和试剂

1.2.1 实验材料

选自皖西学院药用植物园中三年生霍山石斛，品质优良。品种经皖西学院陈乃富教授鉴定为霍山石斛。

1.2.2 实验试剂

表2 材料和试剂

2 实验方法

2.1 样品制备

将新鲜的霍山石斛茎段洗净放于60 ℃鼓风干燥箱内烘干，研磨至粉碎状，装入袋中备用。

2.2 样品中多酚含量的制备及其测定方法

精确称取0.0250 g没食子酸标准品，用蒸馏水定容，得到质量浓度为0.05 mg/mL的没食子酸标准贮备液。精密量取0.5、1.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL没食子酸，在容量瓶中定容成50 mL的标准系列贮备液，再分别吸取各个标准系列贮备液1.0 mL于10 mL容量瓶中，分别加入0.3 mL FC(Folin-Ciocalteu’s phenol Reagent)试剂，充分混匀，加入1.5 mL 20%碳酸钠溶液，用蒸馏水定容，充分混匀，在室温下放置20 min[7]。用蒸馏水作为空白组，用1 cm比色皿测定在760 nm波长的吸光度。绘制标准曲线[8-9]，得到线性回归方程y = 0.4933x+0.0579，R2= 0.9908，见图1。

图1 没食子酸标准曲线

分别取霍山石斛多酚提取液1.00 mL于10 mL的容量瓶中，加入0.3 mL FC试剂，充分摇匀，加入1.5 mL的20%碳酸钠溶液，定容摇匀，在黑暗处放置20 min。将空白组用作试剂空白做对照，用1 cm比色皿测定波长在760 nm处的吸光度，并根据回归方程计算多酚得率。

2.3 单因素实验

通过文献的查阅，采用对溶剂类型、溶剂pH、料液比、溶剂乙醇浓度4个因素进行单因素实验，筛选对霍山石斛总多酚的提取有影响的因素[10-13]。

2.3.1 溶剂类型的选择

精密称取0.5 g霍山石斛，提取溶剂用50% 甲醇、乙醇和丙醇，料液比为1∶30，溶剂的pH为4，过滤得提取液，测量多酚的提取率，并选择最佳提取溶剂。

2.3.2 溶剂浓度的选择

精密称取霍山石斛，乙醇浓度分别为50%～100%，料液比为1∶30，溶剂pH为4，过滤，得到粗提液，得出多酚的得率，并选择最佳的溶剂乙醇浓度。

2.3.3 料液比的选择

精密称取霍山石斛，采用1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40的料液比，80%乙醇为提取溶剂，溶剂pH为4，过滤，得到粗提液，得出多酚的得率，并选择最佳的料液比。

2.3.4 溶剂pH的选择

用软件分析单因素实验结果得出三要素三变量的Box-Behnken试验设计，在该实验结果中选择三个变量值分别标记为A、B和C。

2.5 ABTS自由基清除活性实验

通过文献上的方法，配制ABTS反应液，暗反应16 h，用pH值为7.4的磷酸缓冲液稀释该反应液，吸光度显示在734 nm时值为0.70 ± 0.02结果较佳，分别配出浓度为0.02～0.12 mg/mL的VC液和反应液备用[14-15]。取各浓度的VC液和样品液0.1 mL，混合1 mL ABTS反应液，静置20 min后，在734 nm处测量A，空白组用蒸馏水替代，重复测量3次得到平均值，用公式计算清除率。

清除率=(A空白对照-A样品)/ A空白对照×100%(A为吸光度)

2.6 DPPH自由基清除活性实验

查阅文献，称量11 mg DPPH，70% 的乙醇溶解稀释至100 mL，放到冰箱中备用[16]。配置浓度梯度为0.05 mg/mL到0.20 mg/mL的VC溶液和反应液，各取0.3 mL VC液、样品液，混入0.9 mL DPPH，充分摇匀，暗反应30 min，测量在517 nm的吸光度，用蒸馏水组代替样品液作为空白对比，重复测定3次得到平均值，通过下式计算清除率。

清除率=(A空白对照-A样品)/ A空白对照×100%(A为吸光度)

3 结果与分析

3.1 提取溶剂对霍山石斛多酚提取率的影响

对于从霍山石斛中提取多酚，选择合适的提取溶剂将为该提取带来极大的便利。本次实验的条件为：浓度为50%甲醇、50%乙醇、50%丙酮，料液比1∶30，溶剂pH值为4。过滤提取物得出多酚含量。如下图2所示，乙醇的提取率均高于甲醇和丙酮。由此可知，本次试验采纳乙醇作为霍山石斛多酚的提取溶剂。

图2 溶剂类型对霍山石斛多酚的影响

3.2 溶剂乙醇浓度对霍山石斛多酚提取率的影响

提取溶剂的乙醇浓度梯度别为60%～100%，料液比选择1∶30，溶剂pH值为4。通过图3可以看出，霍山石斛多酚得率在乙醇浓度为80%之前都是呈现出上升的趋势，然而，在超过80%之后，多酚得率趋于下降。因此选择浓度为80%乙醇作为提取霍山石斛多酚组分的最佳溶剂。并且在之后的响应面实验设计中采用70%、80%、90%这3个水平值进行评估。

图3 溶剂乙醇浓度对霍山石斛多酚的影响

3.3 料液比对霍山石斛多酚提取率的影响

分别采用料液比分别为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40作为本次实验变量因素，用80%乙醇作为溶剂，溶剂pH值为4进行本次实验。通过图4可以看出，霍山石斛多酚得率在料液比为1∶35之前，有一个上升的趋势，但在此之后，多酚得率出现开始降低。因此选择料液比1∶35作为从霍山石斛提取多酚组分的最佳比例。并且在之后的响应面实验设计中采用1∶30、1∶35、1∶40这3个水平值进行评估。

图4 料液比对霍山石斛多酚的影响

3.4 乙醇pH值对霍山石斛多酚提取率的影响

本次实验用溶剂pH值作为变量，在料液比为1∶35，80%乙醇，分别进行pH 2、3、4、5、6的单因素实验。通过图5可以看出，霍山石斛多酚得率在pH值为4之前都是呈现出上升的趋势，但是在这之后，多酚得率出现下降的趋势。因此选择pH值为4作为提取霍山石斛多酚组分的最佳pH。并且在之后的响应面实验设计中采用3、4、5这三个水平值进行评估。

图5 溶剂pH对霍山石斛多酚的影响

3.5 响应面优化实验

3.5.1 响应面模型的建立及分析

由单因素试验结果，再用软件对结果进行随机性的筛选进行Box-Behnken 实验设计，见表3。由Design-Expert 8软件进行拟合判断该模型，得多元线性回归方程：

多酚得率= +3.24+0.060A+0.065B-0.072C+0.033AB+0.018AC+0.051BC-0.13A2-0.24B2-0.18C2

(A、B、C 分别代表乙醇浓度、料液比、溶剂pH)

表3 响应面实验设计及其结果

表4 霍山石斛多酚提取率回归方差系数及其显著性检验

通过表4可知，F值为237.36，通过P值的结果可以看出该模型极其显著，以及A、B、C对霍山石斛多酚提取率的影响也有极高的显著性。由F值可以判断出，各因素的影响的大小为：pH>料液比>溶剂浓度。除此之外，失拟项检验P值(0.7146)显示不显著，表明该模型充分拟合并且受其他因素影响较小。此外，该模型的相关系数R2(0.9967)接近1，说明本次模型具有较高的可信度。

由图6可知，实际值和预测值分布相互接近基本呈现为直线，也证实该模型有较好的相关性。

图6 实际值与预测值

3.5.2 效应面分析

利用Design Expert (Version8.0.6) 软件，获得相应二次回归方程的等高线与三维响应面图，如图7所示。根据模型所做的响应曲面及其相应的等高线图可以得出溶剂浓度、料液比以及溶剂pH这3个影响因素对霍山石斛多酚提取率的互相作用, 以及通过控制其中任意一个变量为零水平时确定另外两个变量对霍山石斛多酚提取率的影响，从而确定每个自变量的最佳水平范围。

从图7(a)可以看出，当因子沿A(溶剂浓度)、B(料液比)因子转移到峰值时，因素方向的等高线密度比B因素方向的等高线更加密集，说明更高的溶剂浓度会让霍山石斛多酚得率的波动更大，对多酚得率的影响也更加明显。

图7 溶剂浓度与料液比(a)、溶剂浓度与pH(b)、料液比与pH(c)对多酚提取率影响的等高线与效应面

从图7(b)可以看出，当沿着A(溶剂浓度)、C(溶剂pH)因子分别向峰值移动时，C因子方向的等高线密度比B因素方向的等高线更加密集，说明pH值对霍山石斛多酚得率的贡献更大。

从图7(c)可以看出，当沿着B(料液比)、C(溶剂pH)因素分别向峰值移动时，B因素方向的等高线密度比C因素方向的等高线更加稀疏，说明pH值对霍山石斛多酚得率的贡献更大。

3.6 验证实验

通过上述实验，可以得出获得最佳响应值的优化条件：乙醇浓度为82.5%、料液比为1∶33.74、乙醇pH为4.64。根据上述实验结果，得出的霍山石斛多酚得率为3.026 g/mL，接近预测值，无显著差异，表明从该实验模型得出的结论是可行且可靠的。为了大规模化生产更加方便，最佳响应值优化为乙醇浓度为82%、料液比为1∶34、乙醇pH值为5。

3.7 样品对自由基的清除能力

3.7.1 样品对ABTS自由基的清除能力

VC和样品对ABTS自由基的清除率见图8，从图中可以看出，VC对自由基的清除能力较好，而粗提物的清除能力有依赖性。在低浓度时，霍山石斛多酚在清除自由基的能力和VC对自由基的清除能力存在较大的差距，然而随着总多酚浓度的增加，霍山石斛多酚提取物对ABTS自由基的清除能力逐渐接近VC对ABTS自由基的清除能力，清除能力高达90%，说明粗提物对ABTS自由基有清除能力。

图8 不同浓度VC、总多酚对ABTS自由基清除能力

3.7.2 样品对DPPH自由基的清除能力

VC和样品对DPPH自由基的清除率见图9，从图中可以看出，VC对自由基的清除能力较好。粗提物对自由基的清除能力较之VC更差。在低浓度时，霍山石斛的总多酚在清除ABTS自由基的能力和VC清除DPPH自由基的能力有差距，然而随着总多酚浓度的增加，霍山石斛多酚提取物对ABTS自由基的清除能力逐渐接近VC对DPPH自由基的清除能力，且清除率基本达到90%，表明霍山石斛多酚的提取物对DPPH自由基具有清除能力。

图9 不同浓度VC、总多酚对DPPH自由基清除能力

4 结论

本次实验先由单因素实验的结果确定了溶剂类型、料液比、溶剂pH值、溶剂乙醇浓度四个单因素较好的选择范围，基于此设计响应面法的实验方案，再在此实验方案下进行优化实验，得到霍山石斛多酚组分最佳提取条件，最后进行最佳实验条件下的验证实验。

实验结果表明，溶剂类型、料液比、溶剂pH值、溶剂乙醇浓度这四个单因素对霍山石斛多酚提取率均有影响且相互作用明显。根据建立的二次回归模型，霍山石斛多酚提取的最佳工艺路线是乙醇浓度为82%、料液比为1∶34、乙醇pH值为5，在该实验条件下，霍山石斛多酚的得率为3.026mg/mL。抗氧化活性实验也说明，霍山石斛多酚提取液对ABTS自由基和DPPH自由基有革除作用。霍山石斛多酚在达到一定的浓度后其抗氧化能力与VC相接近，尤其是对自由基有清除作用，表明霍山石斛多酚粗提液有抗氧化能力。但本次实验多酚提取液并没有进行纯化，所以有关结论还需要进行进一步的研究考证。