皂素与十二烷基硫酸钠对阳性血培养瓶直接质谱鉴定处理效果的影响

韦国文，黄丽月

广西河池市人民医院 （广西 河池 547000）

血流感染是败血症和菌血症的统称，是由各种病原微生物（细菌或真菌）及病毒等侵入血液所引起的一类临床综合征。据统计，全球每年约发生20万例血流感染，病死率为20%～50%[1]。有研究报道，血流感染患者抗菌药物治疗每延迟1 h，平均生存率将下降7.6%[2]。近年来，随着临床抗菌药物、免疫抑制剂、抗肿瘤类药物及各类创伤性诊疗手段的应用，血流感染的发病率不断增高，因其致死率高，危害严重，准确快速地检测血流感染越来越受到人们的关注[3-5]。

血培养是通过采集患者血液标本并将其接种到培养瓶中，用以发现、识别引起菌血症或真菌血症的病原微生物，是诊断菌血症或真菌血症的基本且重要的方法[6-7]。近年来，质谱检测技术已被成功用于临床微生物的鉴定中，且其在细菌、酵母菌等鉴定方面均具有良好的应用价值[8-9]。由于其在微生物鉴定领域的优势极大，众多研究人员开始着手进行其在血培养病原菌方面的鉴定研究。阳性血培养液的组分复杂，含有多种干扰微生物鉴定的化合物及病原菌生长代谢物[10]，直接质谱鉴定整体准确率普遍不高[11]，研究人员多采用常规差速离心法以及加入针对血培养液的表面活性剂[如皂素[12]、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）[13]等]法进行研究。本研究通过分析对比皂素、SDS 这两种实验室常用表面活性剂对阳性血培养瓶直接质谱鉴定准确率的影响，并以传统鉴定方法为参考，期望找到一种快速而准确的直接质谱鉴定血培养目标菌的表面活性剂应用方案，以期为感染性疾病的诊断、治疗和预后提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：模拟临床血培养阳性菌出现频次搜集血培养阳性分离菌株共9种56株，菌株详细信息见表1。

表1 菌株信息

试剂：皂素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），SDS[西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司]，上机血培养瓶（安图生物工程股份有限公司），质谱样品处理基质溶液（安图生物工程股份有限公司），甲酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），乙腈[西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司]。

1.2 仪器与设备

BC120自动化血培养系统[安图实验仪器（郑州）有限公司]，Autof ms1000全自动微生物质谱检测系统[安图实验仪器（郑州）有限公司]，Sartorius 1-14离心机（Sigma 公司），微量移液器（Eppendorf 公司）。

1.3 方法

1.3.1 模拟血培养瓶方法

培养活化转接临床菌株24～72 h，刮取单菌落并使用0.9%氯化钠注射液制备100 cfu/ml 浓度菌悬液，吸取100 μl 注入血培养瓶，并注入4～5 ml 新鲜羊血，放入全自动血培养仪内，培养至报阳。

1.3.2 传统鉴定方法

血培养报阳后，根据革兰染色结果将血培养液转接至血琼脂平板或沙保罗培养平板上，37 ℃培养12～48 h，待菌落生长完成挑取1～2个单菌落均匀涂抹靶板，并覆盖1 μl 基质溶液，采集指纹图谱并与标准数据库进行匹配，记录鉴定结果与得分[14]。

1.3.3 皂素法直接鉴定阳性血培养瓶

使用超纯水配制1%、2%、3%、4%、5%浓度梯度皂素溶液，按皂素溶液浓度梯度设置5组验证，每组分别于1.5 ml 离心管中先加入1 ml 阳性血培养液，然后加入200 μl 不同浓度皂素溶液；充分混匀静置3～5 min，以500×g 离心10 min，去除上清液，使用1 ml 0.9%氯化钠注射液重悬沉淀2次，以11 000×g 离心1 min，充分去除上清液并收集沉淀，先加入50 μl 70%甲酸溶液混匀，然后加入50 μl 乙腈混匀，以11 000×g 离心1 min，吸取1 μl 上清液点靶，晾干后覆盖1 μl 基质溶液行质谱鉴定。

1.3.4 SDS 法直接鉴定阳性血培养瓶

使用超纯水配制1%、2%、3%、4%、5%浓度梯度SDS溶液，按SDS溶液浓度梯度设置5组验证，每组分别于1.5 ml 离心管中先加入1 ml 阳性血培养液，然后加入200 μl 不同浓度SDS 溶液；充分混匀后静置（10±5）s，以11 000×g 离心2 min，去除上清液，使用1 ml 0.9%氯化钠注射液重悬沉淀，再次以11 000×g 离心2 min，充分去除上清液，先加入50 μl 70%甲酸溶液混匀，然后加入50 μl 乙腈混匀，以11 000×g 离心1 min，吸取1 μl 上清液点靶，晾干后覆盖1 μl 基质溶液行质谱鉴定。

2 结果与分析

2.1 皂素法与传统鉴定方法的鉴定准确率比较

本研究共设置5组实验组，每组共56份报阳血培养标本，包含57%革兰阳性菌、34%革兰阴性菌及9%酵母类真菌，分别行鉴定准确率测定并将其与传统鉴定方法进行比较，结果见图1。

由图1可知，传统鉴定方法在血培养的质谱鉴定方面有较大的优势，经过处理的56株模拟阳性血培养瓶成功鉴定52株，准确率达92.9%，鉴定时长13～49 h（从血培养瓶报阳计）；皂素溶液的浓度对鉴定准确率有显著的影响，随着皂素溶液浓度增加，鉴定准确率增高，到达4%浓度时达到最优的鉴定准确率[82.1%（46/56）]，鉴定耗时＜1 h（从血培养瓶报阳计），较传统鉴定方法节省了90%以上的时间，继续提高皂素溶液浓度，鉴定准确率未出现显著提升，可能是由于皂素中含有的多种植物成分干扰了质谱峰的鉴定，以金黄色葡萄球菌为例，通过对使用不同浓度皂素溶液进行处理后获取的质谱峰图进行对比（图2），发现对比结果与鉴定成功率结果吻合，经4%皂素溶液处理后的质谱峰图在基线平稳度、峰强度、峰数量方面均优于其他处理方案，因此，4%皂素溶液为较优的配比方案。

2.2 SDS 法与皂素法及传统鉴定方法的鉴定准确率比较

采用不同浓度的SDS 溶液对模拟血培养阳性的培养液进行鉴定处理，并将鉴定结果与皂素法及传统鉴定方法进行比较，结果见图3。

由图3可知，低浓度或高浓度的SDS 溶液均不能达到较好的鉴定效果，在3%浓度时的鉴定准确率最高，达76.8%（43/56），但仍显著低于皂素溶液最高82.1%的鉴定准确率，此外，皂素溶液（4%）及SDS 溶液（3%）的鉴定效果与传统鉴定方法仍存在一定的差距。3种方法的具体鉴定结果见表2，所选标本可分为革兰阳性球菌、革兰阳性杆菌、革兰阴性杆菌及酵母类真菌，根据平均鉴定准确率可分析3种方法在菌株类型方面鉴定的差异（均值越小，差异越大），由表2可知，3种方法在鉴定酵母类真菌时的差异最大，其次是革兰阳性杆菌及球菌，革兰阴性杆菌的差异最小，表明SDS 法、皂素法及传统鉴定方法均能够很好地鉴定此类菌。

表2 SDS 法与皂素法及传统鉴定方法的鉴定结果

大量验证表明，在行阳性血培养瓶直接质谱鉴定时，可将多数鉴定分值为属水平的鉴定直接确定为种水平，鉴定得分低的原因可能是血培养液中成分比较复杂，鉴定结果受代谢物、杂质等的影响。为进一步提高鉴定准确率，我们对皂素表面活性剂直接用于质谱鉴定的评分规则进行了调整，按照经典评分规则，得分＞9.0分为种水平可信，介于6.0～9.0分为属水平可信，＜6.0分为不可信；评分规则优化后，对每个样品设置4个样品点，有不少于2个样品点鉴定结果一致且得分≥6.0分即为可信鉴定，优化后的鉴定准确率达到89.3%（50/56，表2），与传统鉴定方法的鉴定准确率比较无显著差异，表明经过评分优化后的4%皂素溶液可用于阳性血培养瓶的直接质谱鉴定，并且可节省90%以上的鉴定耗时。

3 讨论

血流感染病原菌确诊困难及预后较差等情况一直是困扰临床医患的一大难题，传统鉴定方法在血培养瓶报阳后一般需经过12～48 h 的转接培养获得纯菌落后方能进一步对病原菌进行分析鉴定[15]，而快速而准确地鉴定血流感染病原菌可以极大地降低患者病死率，微生物质谱技术——基质辅助激光解吸飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption / ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）在临床上的应用为这一难题提供了新的思路[16]。

皂素、SDS 是临床常见可直接用于阳性血培养瓶质谱鉴定前处理的表面活性剂，其作用主要在于裂解血细胞，释放微生物菌体，便于后续进行质谱鉴定[17]。由于不同科室及实验室的环境存在差异，使用效果参差不齐，因此，本研究验证了不同浓度的SDS 溶液及皂素溶液的应用效果并将其与传统鉴定方法进行了对比评估，发现浓度为3%的SDS溶液对阳性血培养瓶直接进行质谱鉴定可获得较好的鉴定效果，鉴定准确率达76.8%，但低于4%皂素溶液的鉴定效果82.1%，表明4%皂素溶液相对于SDS 溶液拥有更好的病原菌提纯效果。为进一步提高鉴定准确率，对质谱评分规则进行了调整，定义有不少于2个样品点鉴定结果一致且得分≥6.0分即为可信鉴定，优化后4%皂素溶液的鉴定准确率达到89.3%，与传统鉴定方法的鉴定准确率92.9%比较无显著差异，并且整个前处理过程耗时＜1 h，节省了90%以上的鉴定耗时，表明经过评分优化后的4%皂素溶液在阳性血培养瓶的直接质谱鉴定处理方面拥有较好的应用前景。