基于代谢组学方法分析14种辐照香辛料中的斑蝥素

贾 玮， 杨颖欢， 曾 桥， 蔡露阳， 郭艾艾， 刘树兴*

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021； 2.陕西农产品加工技术研究院， 陕西 西安 710021)

0 引言

香辛料是一类具有香、辛、麻、辣、甜等各种典型风味的植物原料的统称.在采摘、加工、储藏等过程中香辛料易受微生物污染，导致成品或半成品微生物超标，危害人们身体健康.辐照技术能有效地杀灭香辛料的微生物污染，延长储藏期[1,2].香辛料中的植物化学物主要包括萜类、酚类、含硫有机化合物等[3].萜类化合物是以异戊二烯为分子骨架的一类化合物，按结构可分为单萜、倍半萜、二萜、三萜等[4-7].

斑蝥素是半萜烯化合物，常温下为无色无味固体，化学名称为六氢-3a,7a-二甲基-4,7-环氧异苯并呋喃-1,3-二酮，分子式为C10H12O4.药理作用研究表明斑蝥素对多种癌细胞具有较强的抑制活性，如肝癌细胞HepG2、胃癌细胞BGC-823等[5-8].代谢组学是一种旨在识别和量化小分子代谢物的新型研究手段，广泛应用于食品鉴定.质谱分析在仪器和技术方面的迅速发展，促进了代谢组学在食品中的应用[9-13].目前针对香辛料在辐照过程中代谢组学方面的研究较少，因而利用高效液相色谱-质谱联用技术研究辐照后香辛料的代谢产物变化规律对探索香辛料的储藏、运输具有积极的指导作用[14-18].

本文采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道离子阱串联质谱(UHPLC-Q-Orbitrap MS/MS)与代谢组学相结合的分析方法，对14种香辛料在辐照过程中变化显著的斑蝥素进行筛查与变化规律的研究；分析斑蝥素的二级碎裂质谱和碎裂机制模式，获得其特征性碎裂片段.旨在分析香辛料辐照影响因素与探索斑蝥素变化规律，从而为香辛料的质量控制和市场上香辛料的辐照剂量判别提供相关依据.

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

甲酸铵(纯度≧99%，瑞士Fluka公司)；甲酸(纯度≧95%，美国Sigma Aldrich公司)；甲醇(色谱纯，美国Fisher Scientific公司)，斑蝥素标准品(美国Sigma Aldrich公司).香辛料采集于中国52个产地，将其粉碎并过0.30 mm筛网目筛网后分为6等份，转移至聚乙烯塑料袋中并排气，运输至陕西咸阳华科辐照有限公司，依据相关标准法规和文献报道香辛料分别辐照2 kGy、4 kGy、6 kGy、8 kGy、10 kGy[19,20].

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道离子阱串联质谱(美国Thermo Fisher Scientific公司)，配备Syringe自动进样系统、电喷雾离子源和Hypersil Gold C18反相色谱柱(100 mm×2.1 mm×5.0μm)；Avnti J-26×PI型高速冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司)；Vortex.Gaoenie 2T型旋涡混合器(美国Scientific Industries公司)；MIlli Q Integral型纯水仪(美国Millipore公司)；超声波清洗器(江苏昆山超声仪器有限公司).

1.3 样品前处理

称取1.0 g样品(精确至0.01 g)于聚四氟乙烯离心管中，加入10.0 mL甲醇，震荡涡旋，浸泡2 h，超声振荡提取90 min，于10 000 r/min冷冻离心15 min，取1 mL上清液至试管中，加入9.0 mL甲醇，涡旋振荡，取上清液，经0.22μm滤膜过滤后，上机测定.

1.4 高效液相色谱-串联质谱条件

色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18(100 mm×2.1 mm×5.0μm)；柱温：35 ℃；流动相A为水+0.1%甲酸+4.00 mmol/L甲酸铵；B为甲醇+0.1%甲酸+4.00 mmol/L甲酸铵；梯度洗脱程序：0～2 min，12% B；2～5 min，95% B；5～7 min，100% B；7～11 min，100% B；11～15 min，12% B；流速：0.3 mL/min；进样量：5μL.

质谱条件：电喷雾离子化(ESI)离子源，正离子模式，扫描模式Full MS-dd MS2，质量扫描范围m/z100～1 000，鞘气流速为18 L/min，鞘气压力为275 kPa，辅助气流速为3 L/min；毛细管电压为3 500 V，毛细管温度为320 ℃.全扫描模式分辨率设定为70 000 FWHM，自动增益控制的目标值(AGC)设定为10×106，二级扫描模式Full MS/dd-MS2分辨率设定为17 500 FWHM，AGC为5.0×105，TOP 5模式.待碎裂的目标分析物在特定的信息列表(Inclusion list)中设定，容许质量误差范围设定为10 ppm.当待碎裂的离子响应强度达到强度阈值8.3×104时，即送往高能碰撞解离(HCD)碰撞池，通过3个不同的碰撞能量分别进行碰撞，最终叠加得到一张离子谱图，依据碎片离子的响应强度大小最终确定碰撞能量分别为17.5 eV、35.0 eV、52.5 eV.

1.5 标准溶液的配制与标准曲线

称取适量斑蝥素标准品于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成200 mg/L的标准溶液储备液，-18 ℃保存.将标准储备液用甲醇稀释成20 mg/L标准溶液，然后用1.3方法处理得到14种香辛料的基质以及甲醇溶剂配制成10 mg/L、5.0 mg/L、2.50 mg/L、1.0 mg/L、0.50 mg/L、0.25 mg/L和0.10 mg/L系列标准溶液.每个浓度测定3次，以浓度为横坐标(x)，峰面积平均值为纵坐标(y)，得到斑蝥素的标准曲线和线性相关系数.

1.6 方法评价

称取不同香辛料的空白样品，分别添加0.005 mg/kg、0.050 mg/kg、0.50 mg/kg 3个浓度水平的斑蝥素标准溶液，混匀后放置2 h以更接近实际样品中斑蝥素的情况，然后按照1.3实验方法进行提取，每个浓度重复6次；同时将处理得到的空白香辛料提取液加入相应浓度的标准溶液后定容，配制成相应的基质标准溶液，计算添加回收率、相对标准偏差、确定限和检测容量.

2 结果与讨论

2.1 代谢组学分析

采用正离子模式对辐照香辛料的代谢物和质量控制样品进行分析，所得质谱图信号以0.5～14.5 min为主.以辣椒样品为例，运用主成分分析(PCA)研究6组样品中变化显著的物质.PCA模型可表明不同辐照时间辣椒的代谢产物水平的总体轮廓分布，图1(a)结果显示，所得PC1和PC2分别为68.2%和16.5%，充分地解释了样品间的差异性.每组样品均明显分离，且QC(quality control)样品聚集良好，说明仪器状态稳定.

(a)PCA图

为进一步判断不同辐照剂量的变化显著性代谢物，建立PLS-DA模型(图1(b))，该模型可消除背景噪声和组内误差干扰的影响，使样本组间差异最大化.该模型的解释变量R2和可预测变量Q2分别为0.992和0.994，可以很好地解释和预测样本间的差异.上述结果表明，PCA和PLS-DA模型对于不同辐照剂量发生代谢物变化的香辛料样品均能较好地分类.以此类推，14种香辛料中各代谢物在不同辐照剂量下均存在明显差异，经https://www.chemspider.com/分析发现14种香辛料辐照后斑蝥素均发生不同规律的变化.表1为香辛料中斑蝥素的代谢组学参数.

表1 斑蝥素在14种香辛料的色谱信息

2.2 特征碎裂片段筛选及其在香辛料中筛查应用

2.2.1 断裂途径与机理研究

实验研究了斑蝥素的碎裂机理，得到了所有片段的质谱裂解反应途径.其色谱图如图2所示.

图2 标准品斑蝥素色谱峰图

由于电喷雾质谱通过加合质子、加合离子或去质子等方式产生的是偶电子离子，因此该化合物的裂解过程主要为电荷中心诱导的键断裂(i断裂)、电子迁移反应和远端重排反应(γHR).斑蝥素的分子离子质荷比(m/z)的理论值为196.073 01，该分子离子主要的3种碎裂途径见图3所示.由图3可见，在加氢的基础上，分子离子[M+H]+由于电荷中心对相邻-C-O-单键中一对电子的吸引形成i断裂的推动力进而发生电子的转移，电荷中心也因电子的转移而从氧原子转移到断裂后的C原子上，最终又转移到氧原子上.在新形成的电荷中心基础上，发生γHR反应，-C-C-键断裂脱去CH2O2分子后形成m/z151.075 36 C9H11O2+的碎裂片段.该片段结构不稳定，在适宜的条件下脱去一分子CO形成相对稳定的m/z123.080 44 C8H11O+的碎裂片段.其次经加氢后形成的分子离子m/z197.080 84在π电子云迁移的作用下发生γHB反应，-C-C键发生断裂，并且电荷发生转移到对位C的位置，后又在电荷中心的作用下引发i断裂，最终形成m/z95.049 14 C6H7O+的碎裂片段.

图3 斑蝥素碎裂途径分析

2.2.2 特征片段在香辛料筛查中的应用

基于斑蝥素的特征断裂片段信息实现未知成分的筛查.首先，运用vDIA扫描模式获取辐照香辛料样品的质谱信息，利用斑蝥素碎裂片段的精确质量数进行提峰；将捕捉到呈高斯分布且数据点大于10的色谱峰进行汇总，并于斑蝥素标准数据进行比对；其次，通过分析质谱裂解途径、分子离子与碎裂片段信息确定未知化合物的元素组成与分子式；最后，利用标准物质进行确证并进行定量.

例如，在筛查辣椒中未知成分时，利用斑蝥素的特征断裂片段，从总离子流图中提取出色谱质谱信息(如图4所示)，例如1个碎裂片段m/z95.049 08与图4(a)中斑蝥素特征碎裂片段m/z95.049 14具有相同的质谱裂解途径，初步判断该化合物为斑蝥素.其次通过同位素离子峰信息与二级碎裂片段丰度比进行确证，其中色谱共流出的同分异构体是确证的难点.实验中发现3,4-二甲氧基苯乙酸与斑蝥素的保留时间均为7.2 min，分子离子的质荷比均为197.080 83，其碎裂片段相同，但丰度比不同，可通过质荷比为151.057 36与123.080 44两个碎裂片段的响应强度比值进行区别与确证.

(a)标准物质

斑蝥素的主要组成元素(如C、H、O)具有同位素，如具有M+1特征(比分子离子多1个质量单位的峰)的13C.分子离子为天然丰度最高的同位素组合的离子，质谱上与之相对应的具有相同元素的其他同位素组成的离子峰为同位素离子峰.分子离子峰与同位素离子峰的丰度比可应用于确证，如含有1个碳原子时，响应强度比[M]/[M+1]=100/1.1，当分子式中含有n个这类原子时，运用二项式(a+b)n计算同位素相对丰度.如图5所示，通过比对斑蝥素的M+113C丰度比的理论值与实际值来进行确证.分子离子峰与同位素离子丰度比的允许阈值(Allowed intensity deviation)设为10%，最终确定该化合物为斑蝥素.

(a)理论值

2.3 方法参数及样品检测

方法学参数依据欧盟标准2002/657/EC与SANCO/12571/2013相关规定.结果表明，检测方法中斑蝥素在各自浓度范围内呈良好的线性，相关系数(r2)大于0.99.向14种香辛料基质中加入标准溶液，在相同的筛查条件下进行加标回收实验，每个加标水平进行6次测定.采用确定限(CCα)和检测容量(CCβ)表示方法的灵敏度.由表2可知，在14种香辛料基质中斑蝥素的CCα为0.14～1.26μg/kg，CCβ为0.25～1.84μg/kg；不同加标水平下的回收率为84%～112%，相对标准偏差(RSD)为2.8%～7.8%.

表2 斑蝥素在14种香辛料基质中的线性范围、确定限、检测容量、相关系数、平均回收率及相对标准偏差(n=6)

3 结论

本研究建立了UHPLC-Q-Orbitrap MS/MS结合代谢组学分析香辛料在辐照过程中代谢物变化规律的方法.结果表明香辛料在辐照期间斑蝥素随着辐照剂量的增加发生显著变化.同时采用二级碎裂质谱信息研究香辛料在辐照过程中斑蝥素的裂解机理，获得斑蝥素的特征碎裂片段m/z95.049 08 C6H7O+，m/z123.080 44 C8H11O+及m/z 151.075 36 C9H11O2+.方法学参数考察证明该方法具有灵敏度高、选择性强、质量精确度高的特点.方法学验证中，在14种香辛料中的斑蝥素在线性范围内均具有良好的线性关系，检出限及回收率满足国内外标准的要求，适用于斑蝥素低含量的定性确证与定量检测，可广泛应用于辐照中香辛料的品质判断.