喉癌组织中Sox2、cMyc表达与其临床病理特征及预后的相关性

何晓丽 江洪 邓夏

喉癌是常发于头颈部的恶性肿瘤之一，其中鳞状细胞癌是其最主要的病理类型，可高达90%以上［1］。近年来随着人们生活行为习惯的改变，喉癌的发病率及死亡率不断上升，严重危害患者的生命安全。国内的流行病学调查表明，喉癌的5年生存率不到80%；而美国的研究也显示，在过去40年里，喉癌的5年生存率已经从原来的66%降低至63%［2-3］。因此，针对喉癌患者预后生存率较差等问题，寻找与其病理特征、预后相关的特异性标志物已成为当前研究的热点之一，对于喉癌的病情监测、预后评估及靶向治疗新靶点的提示等均具有重要的意义。而随着分子生物学的快速发展，喉癌预后评价的分子生物学指标体系也得到不断补充和完善。研究表明［4-6］，Sox2、cMyc是多种恶性肿瘤预后不良的风险因素，然而目前关于二者与喉癌的发生发展存在何种关联尚不清楚。本研究检测98 例喉癌组织中SOX2、cMyc的表达情况，并分析探讨二者与喉癌患者临床病理特征及预后的相关性。报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2017年1月至2021年1月重庆医科大学附属永川医院二鼻咽喉头颈科收治的98 例经病理确诊的喉癌患者为研究对象。其中男性55 例，女性43 例；年龄平均（61.84±9.57）岁。分化程度：高分化35 例，中分化36 例，低分化27 例。T 分期：T1+T2 期47 例，T3+T4 期51 例；淋巴结转移：有36 例，无62 例；临床分型：声门上型38 例，声门型54 例，声门下型6 例；临床分期：Ⅰ+Ⅱ期50 例，Ⅲ+Ⅳ期48 例。以于98 例喉癌患者的肿瘤部位取材的喉癌组织标本作为喉癌组，同时以98 例患者对应癌旁正常组织（即距离肿瘤切缘0.5 cm 以上部位）取材标本作为癌旁组。

纳入标准：①癌组织经术后病理学诊断均为鳞状细胞癌［7］；②均为初次治疗且近期未接受放化疗或其他治疗者；③均有完整的临床资料及随访记录；④患者或家属均知情并签署同意书。排除标准：①合并其他恶性肿瘤患者；②伴有重要脏器功能障碍者；③肿瘤已出现远处转移者；④依从性极差或中途退出研究者。本研究已获得医院伦理研究委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂

兔抗人SOX2单克隆抗体，兔抗人CMYC单克隆抗体，免疫组化EnVision 二抗，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.2 免疫组化法检测Sox2、cMyc的表达

取石蜡包埋切片，进行常规脱蜡和水化处理，采用柠檬酸钠缓冲液进行热抗原修复，以3% H2O2溶液于室温孵育15 min，PBS 洗涤2 次，每次5 min。滴加兔抗人SOX2、CMYC 单克隆抗体（1∶200），4℃孵育过夜，复温后再次进行3 次PBS洗涤（5 min/次），使用DAKO EnVision 二抗系统室温孵育30 min。室温下进行DAB 显色约5 min，苏木素复染2 min，采用中性树胶将冲洗干燥后的切片进行封片，镜检。以PBS 作为一抗作阴性对照。全部染色切片由2 位工作经验≥5年的资深病理医师进行双盲法阅片，独立评估免疫组化结果。免疫组化阳性判定标准［8］：SOX2、CMYC的阳性着色表达于肿瘤细胞胞质或细胞核中，呈棕黄色或棕褐色细小颗粒。①着色强度评分：与背景对比，无色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色或黑色为3 分。②阳性细胞比例评分：随机采集10 个代表性视野，根据公式“阳性细胞比例=阳性细胞数/肿瘤细胞数×100%”进行阳性细胞比例计算。以阳性细胞比例＜5%为0 分，阳性细胞比例5%～25%为1 分，阳性细胞比例26%～50%为2 分，阳性细胞比例51%～75%为3 分，阳性细胞比例＞75%为4 分。将着色强度评分与阳性细胞比例评分相乘，其乘积总分≤3 分为阴性、＞3 分为阳性。

1.2.3 随访

所有患者均通过电话或门诊复诊形式随访，以患者死亡为终点事件，本研究中末次随访截止日期为2021年12月31日，无失访。随访时间至少1年，生存84 例，死亡14 例。

1.3 统计学方法

应用SPSS 21.0 统计学软件进行数据分析。计数资料以n（%）表示，采用χ2检验；并以Cox风险比例模型分析Sox2、cMyc表达与喉癌预后的关系。以Kaplan-Meier法绘制生存曲线，并以Log-Rank法进行组间生存差异检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 喉癌和癌旁组织中Sox2、cMyc阳性表达率比较

喉癌组的Sox2、cMyc阳性表达率均明显高于癌旁组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图1。

表1 喉癌和癌旁组织中Sox2、cMyc 的表达率比较［n（%）］Table 1 Comparison of Sox2 and cMyc expression in laryngeal carcinoma and adjacent tissues［n（%）］

图1 喉癌和癌旁组织中Sox2、cMyc 的表达（SP，×200）Figure 1 Expression of Sox2 and cMyc in laryngeal carcinoma and adjacent tissues（SP，×200）

2.2 Sox2、cMyc 阳性表达与临床病理特征的关系

喉癌组织的Sox2、cMyc阳性表达与T 分期、淋巴结转移有关（P＜0.05）；而与年龄、性别、吸烟史、饮酒史、临床分期、临床分型、分化程度无明显相关性（P＞0.05）。见表2。

表2 Sox2、cMyc 阳性表达与临床病理特征的关系［n（%）］Table 2 Correlation between positive expression of Sox2 and cMyc and clinicopathological features［n（%）］

2.3 影响喉癌预后的单因素分析

本研究喉癌患者的1年生存率为85.71%（84/98）。单因素分析结果显示，淋巴结转移、临床分期、T 分期、Sox2及cMyc是影响喉癌预后的危险因素（P＜0.05）。见表3。

表3 影响喉癌预后的单因素分析［n（%）］Table 3 Single factor analysis of prognosis of laryngeal cancer［n（%）］

2.4 影响喉癌患者预后的Cox 回归分析

以喉癌患者预后为因变量进行Cox多因素回归分析，结果显示，T 分期、淋巴结转移、Sox2阳性、cMyc阳性为喉癌预后不良的独立影响因素（P＜0.05），见表4。Sox2阳性表达组（80.82%）1年生存率低于阴性表达组（100.00%），cMyc阳性表达组（80.28%）1年生存率低于阴性表达组（100.00%），差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表4 影响喉癌患者预后的Cox 回归分析Table 4 Cox regression analysis of influence on prognosis of patients with laryngeal cancer

3 讨论

喉癌是指起源于喉黏膜的一种头颈部原发性肿瘤，恶性程度较高，预后较差［8］。目前喉癌的治疗手段主要有手术、放化疗等，但预后仍不够理想［9］。至今临床上仍未阐明喉癌确切的发病机制，但研究已证实癌基因的复杂调控参与恶性肿瘤的进展过程，同时也是诱发喉癌患者不良预后的关键因素之一［10］。SOX2基因是一种干细胞转录因子，在维持胚胎干细胞的全能性中扮演着重要角色。现代研究已将SOX2基因确定为鳞状细胞癌癌基因谱，其异常表达与胰腺癌、乳腺癌、肾癌等多种恶性肿瘤的生长、浸润及转移有关，但目前关于其在喉癌中的研究较少［11］。cMyc基因属于一种原癌基因，不仅参与细胞周期的调控过程，还可作为转录蛋白发挥促进或抑制细胞增殖、分化的双向调节作用。研究表明［12］，cMyc的表达与子宫内膜癌、弥漫性大B 细胞淋巴细胞瘤、肺癌等肿瘤的发生发展密切相关，但目前cMyc在喉癌的研究鲜见报道。

本研究结果提示喉癌患者肿瘤组织中的Sox2、cMyc表达异常，可能会促进患者肿瘤恶性进展，进而导致不良预后。cMyc基因位于染色体8q24，具有双向调节作用，其编码产物在机体新血管生成、细胞增殖分化等病理及生理过程均可扮演着核心角色［13］。cMyc在健康机体细胞中的表达很少，但一旦发生过度表达，可通过激活一系列细胞相关调节因子的表达而促使细胞从静止期向分裂周期过渡，从而起到抑制细胞的凋亡及促进细胞的增殖的作用，进而诱导肿瘤的生长、转移［14］。SOX2基因位于染色体3q26.33，是SOX基因家族的主要成员之一，具有高迁移率族（HMG）特征性结构域，可参与机体的组织、胚胎发育以及干细胞的自我更新、分化等的调控过程中［15］。孟新雨等［16］的研究发现，SOX2蛋白在喉癌组织的表达水平较癌旁组织更高，且其表达与淋巴结转移、T 分期有关，与本研究结果基本一致。原因可能是由于SOX2的异常表达使机体肿瘤或胚胎干细胞相关凋亡及阻滞因子的活性受到干扰，从而促进了肿瘤细胞的侵袭、迁移进程。本研究结果提示SOX2、cMyc可能参与促进了喉癌的恶化过程，有可能成为病情监测与预后评估的重要指标之一。

综上所述，喉癌组织中的Sox2、cMyc异常高表达，且其表达与T 分期、淋巴结转移及预后密切相关，其表达情况可反映喉癌患者病情进展和预后状况，有可能成为喉癌肿瘤进展检测及预后评估的特异性指标。但本研究的样本量较小，仍需扩大大样本进行进一步的前瞻性分析以验证。同时，关于Sox2、cMyc具体如何调节喉癌生长、浸润的通路机制问题，未来仍需学者继续进行研究以阐明。