二十五味珍珠片抗PM2.5作用及机制的探究*

多杰卓玛 黄燕烽 梅之南 周生军 彭逸 陈维武**(.西藏奇正藏药股份有限公司，西藏 拉萨 85000；.杭州环特生物科技股份有限公司，浙江 杭州 005；.中南民族大学，湖北 武汉 40074)

细颗粒物(fine particulate mate,PM2.5)是大气污染中危害人体健康的重要危险因素，因其粒径小、活性强，故其表面可以富集大量的有毒有害物质，并可通过呼吸系统直接透过肺泡进入血液损害人体健康[1-2]。流行病学调查数据表明，PM2.5颗粒污染与支气管炎等呼吸系统疾病、血栓等心血管疾病以及肥胖和2型糖尿病的发生率密切相关[3-4]。过量的PM2.5颗粒暴露能够增加机体的氧化应激水平和脂肪组织以及肺部乃至全身的慢性炎症水平，促进支气管哮喘、阻塞性肺气肿的急性发作，严重者可诱发心肌梗塞、心力衰竭等重大心血管疾病[5-6]。因此，免疫系统是机体对PM2.5反应的主要系统之一，尤其巨噬细胞对细颗粒物的吞噬是机体清除PM2.5重要途径之一。此外，有研究表明空气污染物尤其是PM2.5能够损害肠道细菌，影响肠道的微环境健康等[7]，并且经肠道排除PM2.5也是机体清除PM2.5的重要途径。目前针对PM2.5的药物研究较少，临床上也并无靶向PM2.5清除的有效药物。

二十五味珍珠片是始载于藏族医名著《四部医典》中的经典名方，其主要成分有珍珠、肉豆蔻、石灰华、草果、丁香、降香、豆蔻、诃子、檀香、螃蟹、牛黄、人工麝香等二十五味药材，具有安神开窍、舒筋活络之功效，目前临床上主要用于治疗中风、脑血栓后遗症等神经性疾病、心脑血管疾病和精神障碍性疾病[8-10]。较多的研究表明二十五味珍珠片能够改善机体微循环，从而缓解改善心血管疾病的发生发展[11-13]。本研究拟在探讨斑马鱼模型中二十五味珍珠片是否能够改善体循环促进PM2.5类似物纳米活性炭颗粒的外排从而产生抗PM2.5的作用。我们发现二十五味珍珠片能够增加机体两种纳米活性炭颗粒的外排途径，即增加巨噬细胞的吞噬作用和改善肠道功能、促进肠道蠕动外排，从而增加纳米活性炭颗粒的外排，为临床上靶向PM2.5的药物选择提供一定的参考依据。

1 仪器与材料

1.1仪器 SMZ645解剖显微镜、AZ100电动聚焦连续变倍荧光显微镜(Nikon公司)；CP214精密电子天平(奥豪斯公司)；IM-300显微注射仪、PC10拉针仪(Narishige公司)。

1.2试药 二十五味珍珠片，奇正(北京)传统藏医药外治研究院有限公司提供，批号：Z20130023，按浓度水溶后给药；甲基纤维素、吲哚美辛，阿拉丁试剂有限公司；中性红、脂多糖、尼罗红，Sigma公司；纳米活性炭颗粒，西安齐岳生物科技有限公司。

1.3实验动物 黑色素等位基因突变型Albino品系斑马鱼、转基因中性粒细胞荧光斑马鱼，购自国家水生生物种质资源库国家斑马鱼资源中心，以上斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中，以自然成对交配方式进行繁殖，实验动物使用许可证号为：SYXK(浙)2012-0171，饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。

2 方法

2.1对斑马鱼最大耐受浓度(MTC)测定 随机选取330尾受精后2 d(受精后天数，days post fertilization,dpf)黑色素等位基因突变型Albino品系斑马鱼，分别水溶给予二十五味珍珠片62.5、125、250、500和1000 μg·mL-1浓度，同时设置正常对照组(即养鱼用水处理斑马鱼)，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼，每孔容量为3 mL。连续观察记录5 dpf至7 dpf，并观察记录斑马鱼的反应和死亡情况并移除死亡的斑马鱼。统计各实验组的斑马鱼死亡数量和毒性情况，确定二十五味珍珠片对斑马鱼的最大耐受浓度(MTC)。

2.2对斑马鱼巨噬细胞吞噬纳米活性炭的影响 选取120尾黑色素等位基因突变型 Albino品系斑马鱼进行静脉注射纳米活性炭后随机分为对照组和实验组，实验组给予不同浓度二十五味珍珠片水溶液(27.8、83.3、250 μg·mL-1)，对照组给予溶剂对照，处理2 d后，加入中性红溶液对斑马鱼进行活体染色，统计吞噬了纳米活性炭的巨噬细胞的数量(N)，并根据巨噬细胞吞噬促进率来评价二十五味珍珠片对斑马鱼巨噬细胞吞噬功能的影响。巨噬细胞吞噬促进作用(%)= [N(实验组)/N(模型组)-1]×100%。

2.3对肠道功能改善的影响 如上选取120尾同系斑马鱼进行肌内注射给予纳米活性炭后随机分为对照组和实验组，给予不同浓度的二十五味珍珠片水溶液或者溶剂对照，5 d后，统计肠道内有纳米活性炭的斑马鱼数量(Z)，以评价二十五味珍珠片对纳米活性炭分泌功能的影响。分泌发生率(%)=Z(纳米颗粒分泌入肠道)/ Z(总数)×100%。

2.4对肠道蠕动功能的影响 随机选取120尾野生型AB品系斑马鱼，给予尼罗红16 h后随机分为对照组和实验组。给予不同浓度的二十五味珍珠片水溶液处理6 h后，每组随机取10尾斑马鱼在荧光显微镜下观察斑马鱼肠腔中荧光染料信号强度、拍照后进行图像分析，计算斑马鱼肠腔中荧光染料的信号强度(S)，以评价二十五味珍珠片促进肠道蠕动功能。肠蠕动促进率(%)= [1-S(实验组)/S(模型组)]×100%。

2.5对斑马鱼炎症消退的影响 随机选取120尾转基因中性粒细胞荧光斑马鱼，分别给予不同浓度的二十五味珍珠片水溶液和阳性对照药吲哚美辛(60 μM)，处理 1 h 后，卵黄囊注射脂多糖后再分别同样药物干预2 h后，统计斑马鱼卵黄囊内中性粒细胞个数(N)。炎症消退作用百分比(%)= [(N(模型组)-N(实验组)/ N(模型组)]×100%。

2.6统计学方法 采用 SPSS软件进行统计学分析，数据以平均数±标准误表示。数据前后对比采用配对t检验，组间对比采用单因素方差分析，P<0.05为有差异具有统计学意义。

3 结果

3.1对斑马鱼最大耐受浓度(MTC)测定 二十五味珍珠片62.5、125和250 μg·mL-1浓度组斑马鱼均未出现死亡，上述三组均未发现任何异常表型，500和1000 μg·mL-1浓度组斑马鱼全部死亡。因此斑马鱼对二十五味珍珠片的最大耐受浓度为250 μg·mL-1。见表1。

表1 二十五味珍珠片“浓度-死亡率”(n=30)

3.2对斑马鱼巨噬细胞吞噬纳米活性炭的影响 确定模型建立成功后，与模型组(16个)相比，二十五味珍珠片浓度为27.8、83.3和250 μg·mL-1时，斑马鱼体内吞噬了纳米活性炭的巨噬细胞数量分别为37、35和36个(P<0.001)，巨噬细胞吞噬促进率分别为131.3%、118.8%和125.0%，提示二十五味珍珠片在27.8、83.3和250 μg·mL-1浓度时对斑马鱼巨噬细胞吞噬功能都有明显的促进作用。(见图1和表2)。

黑色区域为斑马鱼脑部巨噬细胞统计区域，其中黄色箭头所指为吞噬了纳米活性炭的巨噬细胞，由于其吞噬了纳米活性炭，颜色比正常的巨噬细胞要深。

表2 对巨噬细胞吞噬功能的促进作用

3.3对斑马鱼肠蠕动的促进作用 二十五味珍珠片浓度为27.8、83.3和250 μg·mL-1时，纳米活性炭分泌发生率分别为16.7%、36.7%和36.7%，与模型组(23.3%)相比，结果无统计学差异，提示二十五味珍珠片对斑马鱼纳米活性炭分泌进入肠道没有促进作用(见表3)。我们进一步检测了各组斑马鱼的肠蠕动功能，二十五味珍珠片在浓度为27.8、83.3和250 μg·mL-1时，斑马鱼肠腔荧光强度分别为578095、511274和223950像素，其肠蠕动促进率分别为25.5%、34.1%和71.2%，与模型组(776340像素)比较，三组给药组均具有统计学差异(P<0.001)，提示二十五味珍珠片能够促进斑马鱼肠蠕动，从而促进纳米活性炭的外排(见表4)。

表3 对斑马鱼体内纳米活性炭分泌的影响(n=30)

表4 对斑马鱼肠蠕动促进率的影响(n=10)

3.4二十五味珍珠片对于脂多糖诱导的中性粒细胞的影响 二十五味珍珠片浓度为27.8、83.3和250 μg·mL-1时，斑马鱼卵黄囊内中性粒细胞数量分别为21.4、21.6和18.6个，与模型组(21.7个，P> 0.05)无统计学差异；其对斑马鱼炎症消退率分别为1.4%、0.5%和14.3%，提示二十五味珍珠片对LPS诱发的炎症没有改善作用(见表5)。

表5 二十五味珍珠片对LPS诱发的炎症实验结果(n=10)

4 讨论

经济的不均衡发展不可避免地导致大气污染日益严重，大气中的主要污染物PM2.5浓度随之增大。PM2.5具有粒径小，面积大，活性强、易附带有毒有害物质且在大气中的停留时间长、输送距离远等特点，对人体健康影响巨大[1]。大量研究表明，长期暴露于PM2.5与更高的肥胖风险、心血管疾病、2型糖尿病和肺癌等疾病风险有关。目前，临床上靶向干预PM2.5药物的研发仍处于起步阶段[4-5]。

二十五味珍珠片是藏药中的经典名方，其主要有珍珠、肉豆蔻、石灰华、草果、丁香、降香、豆蔻、诃子、檀香、螃蟹、牛黄、人工麝香等二十五味药，具有安神开窍、舒筋活络之功效，目前临床上主要用于治疗中风、脑血栓后遗症等神经性疾病、心脑血管疾病和精神障碍性疾病[9]。有研究表明二十五味珍珠片能够改善大脑局部微循环，从而改善脑血栓后遗症以及缺血性脑卒中等；并且二十五味珍珠片可以扩张冠状动脉、改善心电图表现和降低血液黏度等，有助于缓解冠心病心绞痛等[10]。此外，也有研究表明二十五味珍珠片具有缓解血管内皮损伤并促进血管内皮再生等功效。因此，二十五味珍珠片是否能够改善体循环和免疫应答等功能促进PM2.5的外排从而产生抗PM2.5的作用非常值得研究。

免疫系统对PM2.5的反应有两面性:一方面是免疫系统尤其是免疫细胞能够吞噬PM2.5，将其通过消化系统等排出体外；另一方面免疫系统的反应也是机体受损的原因之一[14-17]。PM2.5其本身能够刺激免疫细胞产生的大量的促炎性细胞因子，从而导致机体的炎症反应，此外，PM2.5刺激机体产生特异性的IgE，促进白三烯、组胺等过敏反应相关因子的分泌，从而导致哮喘等过敏性疾病[18-19]。尤其在肺部慢性疾病的发病过程中，PM2.5的亚慢性暴露可以造成机体的持续性炎症损伤，并导致巨噬细胞的吞噬功能下降[20-21]。因此我们的研究重点观察了二十五味珍珠片对巨噬细胞吞噬PM2.5类似物纳米活性炭颗粒的作用，以及二十五味珍珠片对PM2.5类似物纳米活性炭颗粒的外排促进作用。结果表明静脉注射PM2.5类似物纳米活性炭颗粒时，二十五味珍珠片能够显著增加斑马鱼巨噬细胞对PM2.5类似物纳米活性炭颗粒的吞噬；我们的研究还发现二十五味珍珠片能够促进PM2.5的另一条外排途径即肠道分泌和外排，虽然给药后PM2.5类似物的肠道分泌情况并没有显著改善，但是二十五味珍珠片显著促进了斑马鱼肠道的蠕动，进而促进PM2.5的外排，进一步提示二十五味珍珠片可以加速机体代谢PM2.5。进一步，我们希望观察二十五味珍珠片能否改善PM2.5类似物引起的免疫系统炎症，并进一步检测其对炎症信号如NF-κB等有无作用，因此我们观察了二十五味珍珠片对LPS诱导的炎症的作用，然而，结果表明二十五味珍珠片对LPS引起的炎症并无较大的改善作用。

综上，二十五味珍珠片能够增加巨噬细胞的吞噬作用，促进肠道蠕动，增加PM2.5类似物纳米活性炭颗粒的外排，联合应用促进PM2.5类似物纳米活性炭颗粒的肠道分泌和抗炎药物有助于进一步应用于防治PM2.5引起的相关疾病。本实验中二十五味珍珠片的药效学评价主要在斑马鱼模型上完成，还需在哺乳动物模型和临床试验中做进一步验证。