ER-β对三阴性乳癌细胞生物学行为和IL-8表达影响

姚瑶,吕志栋,夏菁,崔茹婷,孔滨

[摘要]目的   探讨雌激素受体β（ER-β）对三阴性乳癌细胞生物学行为和白细胞介素8（IL-8）表达的影响。方法   构建外源性ER-β慢病毒表达载体，转染人三阴性乳癌细胞MDA-MB-231。将细胞分为正常对照组、过表达组、阴性对照组和IL-8干预组。通过细胞增殖、细胞迁移实验及流式细胞术分别观察各组细胞增殖、迁移及凋亡的变化。采用蛋白印迹实验法检测各组细胞中ER-β、IL-8及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3表达。结果   ER-β过表达慢病毒转染MDA-MB-231细胞后，ER-β的表达明显增加，而IL-8表达明显降低（F=31.17、60.26，P<0.05）。上调ER-β的表达明显抑制了MDA-MB-231的增殖和迁移能力，并促进凋亡率的增加（F=70.89～459.50，P<0.05），同時增加凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2和Cleaved caspase-3的表达（F=20.67、89.64，P<0.05）。 但是外源性IL-8能够部分逆转ER-β对细胞迁移能力及凋亡的调控作用（P均<0.05），而对增殖无明显影响（P>0.05）。 结论   上调ER-β的表达可以抑制IL-8的表达，从而抑制三阴性乳癌细胞迁移并促进其凋亡。

[关键词]三阴性乳癌;雌激素受体β;白细胞介素8;细胞运动;细胞凋亡

[中图分类号]R737.9;R392.11

[文献标志码]A

[文章编号]2096-5532（2022）04-0480-06

doi： 10.11712/jms.2096-5532.2022.58.093[HT]

[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

[网络出版]https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.r.20220617.1644.008.html;[JY]2022-06-2108：21：08

EFFECT OF ESTROGEN RECEPTOR-β ON THE BIOLOGICAL BEHAVIOR AND INTERLEUKIN-8 EXPRESSION OF TRIPLE-NEGATIVE BREAST CANCER CELLS

YAO Yao， L Zhidong， XIA Jing， CUI Ruting， KONG Bin

（Department of Breast Disease Center， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266100， China）

[ABSTRACT] Objective[WTBZ] To investigate the effect of estrogen receptor-β （ER-β） on the biological behavior and interleukin-8 （IL-8） expression of triple-negative breast cancer cells.

Methods[WTBZ] A lentiviral vector overexpressing exogenous ER-β was constructed and transfected into human triple-negative breast cancer MDA-MB-231 cells， which were divided into normal control group， overexpression group， negative control group， and IL-8 intervention group. CCK-8 assay， Transwell assay， and flow cytometry were used to observe the changes in cell proliferation， migration， and apoptosis， and Western blot was used to measure the expression of ER-β， IL-8， and the apoptosis-related proteins Bax， Bcl-2， and Cleaved caspase-3 in each group.

Results[WTBZ] After MDA-MB-231 cells were transfected with the ER-β overexpression lentivirus， there was a significant increase in the expression of ER-β and a significant reduction in the expression of IL-8 （F=31.17，60.26;P<0.05）. Upregulation of ER-β expression significantly inhibited the proliferation and migration abilities of MDA-MB-231 cells， promoted the increase in apoptosis rate （F=70.89-459.50，P<0.05）， and increased the expression levels of the apoptosis-related proteins Bax/Bcl-2 and Cleaved caspase-3 （F=20.67，89.64;P<0.05）. However， exogenous IL-8 partially reversed the regulatory effect of ER-β on cell migration and apoptosis （all P<0.05）， but with no significant effect on proliferation （P>0.05）.

Conclusion  Upregulation of ER-β expression can inhi-

bit the expression of IL-8， thereby inhibiting the migration of triple-negative breast cancer cells and promoting their apoptosis.

[KEY WORDS]  triple negative breast neoplasms; estrogen receptor beta; interleukin-8; cell movement; apoptosis

三阴性乳癌（TNBC）是乳癌中最具侵袭力的一种亚型，具有较高的局部复发和远处转移率，给健康带来巨大威胁[1]。目前，对于TNBC病人内分泌治疗是需要探索的领域。雌激素在乳癌中通过雌激素[LL]受体α（ER-α）和雌激素受体β（ER-β）两个核受体发挥其作用[2]。ER-β首次发现至今已有30余年，在乳癌中的确切作用仍有争议[3]。白细胞介素8（IL-8）也称作CXCL8，是趋化因子的一种[4]。IL-8被证实可联合血管内皮生长因子建立肿瘤新的脉管系统，从而促进乳癌的发生发展[5]。有研究表明，ER-β可通过炎症通路来调控IL-8等相关炎性因子进而抑制前列腺癌的发生发展[6]。同时也有研究证实，在乳癌中ER-β可上调IL-8的启动子活性，从而促进乳癌的侵袭[7]。本研究以TNBC细胞MDA-MB-231为模型，探讨了ER-β对IL-8的调控作用并进一步验证其对乳癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响。

1材料和方法

1.1实验材料

人乳癌细胞株MDA-MB-231由湖北普诺赛公司提供。ER-β过表达慢病毒（Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin，上海吉凱公司），高糖DMEM培养液（大连美仑公司），胎牛血清（进阶生物公司），人重组IL-8（苏州派普泰克公司），CCK-8细胞增殖检测试剂盒和结晶紫（北京索莱宝公司），Annexin V-7ADD/PE凋亡检测试剂盒（美国BD公司），抗ER-β、Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3单克隆一抗（美国CST公司），抗IL-8单克隆一抗（上海艾博抗公司），二抗及GAPDH一抗（武汉伊莱瑞特公司）。荧光显微镜、倒置相差显微镜（日本Olympus公司），酶标仪（瑞士Tecan公司），流式细胞仪（美国Apogee公司），显影仪（赛默飞世尔科技公司）。

1.2实验方法

1.2.1 细胞培养与分组MDA-MB-231细胞接种在含有体积分数0.10胎牛血清的DMEM培养液中，置于37 ℃、体积分数0.05 CO2培养箱中，细胞汇合度90%左右传代。实验分组：未转染的人乳癌细胞为正常对照组（a组），转染ER-β过表达慢病毒为过表达组（b组），载体空载为阴性对照组（c组），在转染ER-β过表达慢病毒后再使用人重组IL-8（150 μg/L）为IL-8干预组（d组）。

1.2.2 细胞转染将对数生长期的乳癌细胞接种在6孔板中，当细胞汇合度达到60%～70%时，更换1 mL含有体积分数为0.10胎牛血清的高糖DMEM培养液，ER-β过表达组加入40 μL助转试剂A和2 μL的 ER-β过表达慢病毒，空载组加入40 μL助转试剂A和2 μL阴性对照慢病毒，轻轻晃匀，根据细胞状态8～12 h后换液。72 h后荧光显微镜下观察，取稳定转染的细胞用于后续实验。

1.2.3 细胞增殖实验将各组按每孔5×103个细胞接种于96孔板中，设置5个复孔。24 h后每孔更换90 μL完全培养液，并加入10 μL 的CCK-8试剂，37 ℃、避光孵育2 h后使用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度，连续测量5 d。细胞活力以OD值表示。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡分别收集各组细胞1×105个，以PBS洗涤2次后重悬于100 μL的1×Binding buffer中，分别在细胞悬液中加入Annexin V-7ADD和PE试剂各5 μL，在常温、避光条件下孵育20 min，使用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。

1.2.5 细胞迁移实验将各组细胞用无血清的高糖DMEM接种于24孔Transwell板的小室中，每孔1×105个。每孔加入500 μL含体积分数0.20胎牛血清的高糖DMEM培养液，培养24 h后弃培养液，擦去小室内的细胞，以40 g/L的多聚甲醛固定30 min，用1 g/L的结晶紫染色30 min，随机选取5个视野拍照。

1.2.6 蛋白印迹实验收集细胞沉淀，加入160 μL预冷的RIPA裂解液和1 μL蛋白酶抑制剂，BCA法测定蛋白浓度。将上样缓冲液按1∶4的比例与总蛋白混匀，在95 ℃下加热5 min。选用150 g/L的SDS-PAGE胶分离电泳（每孔30 μg），然后转到PVDF膜上，再用50 g/L脱脂奶粉封闭2 h。TBST洗涤PVDF膜3次，一抗孵育过夜（4 ℃），二抗孵育1.5 h。 ECL发光成像，使用Image J软件分析目的条带灰度值，以GAPDH为内参照。

1.3统计学方法

使用Graph Pad Prism 8软件进行统计分析。计量资料数据以[AKx-D]±s表示，多组间均数比较使用单因素方差分析，不同天数组间细胞增殖的比较采用析因设计方差分析，两两比较使用单因素LSD法。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1ER-β过表达慢病毒转染效率检测

ER-β过表达及空载慢病毒转染72 h后，在荧光显微镜下观察有90%以上的细胞内绿色荧光蛋白（GFP）表达阳性（图1）。Western blot半定量分析表明，3组ER-β蛋白表达量差异具有统计学意义（F=60.26，P<0.05），过表达组（0.52±0.10）高于正常对照组（0.06±0.01）和阴性对照组（0.06±0.01）;3组IL-8的蛋白表达量差异具有统计学意义（F=31.17，P<0.05），过表达组（0.10±0.02）低于正常对照组（0.22±0.03）和阴性对照组（0.20±0.01）。见图2。提示慢病毒转染能够明显增加乳癌细胞中ER-β的表达，同时降低IL-8的表达。

2.2ER-β对人乳癌细胞增殖能力的影响

CCK-8检测结果显示，ER-β过表达抑制了细[CM）]胞活力，不同时间、不同组别及其二者交互比较，差异均有统计学意义（F时间=1 351.00，F组别=215.20，F时间×组别=70.89，P<0.05）。转染第1、2天，4组间差异无统计学意义（P>0.05）。值得注意的是，第3～5天，正常对照组的细胞活力值分别为0.53±0.01、0.79±0.01和1.18±0.04，阴性对照组分别为0.53±0.01、0.77±0.01和1.14±0.06，这两组间差异无统计学意义（P>0.05）;[JP2]过表达组分别为0.41±0.01、0.54±0.03和0.68±0.04，这3组间差异均具有统计学意义（P<0.05）。IL-8干预组第1～5天的细胞活力值则分别为0.32±0.02、0.38±0.02、0.45±0.01、0.54±0.02和0.72±0.02，与过表达组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图3。

2.3ER-β对人乳癌细胞迁移能力的影响

细胞迁移实验的结果显示，正常对照组的迁移细胞数量为每高倍视野545.00±27.94，过表达组为291.30±11.59，阴性对照组为554.00±18.68，IL-8干预组为443.70±39.55，4组细胞的迁移能力比较差异有显著意义（F=84.84，P<0.05）。正常对照组与阴性对照组迁移细胞数比较，差异无统计学意义（P>0.05）;而过表达组则明显少于正常对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）;IL-8干预组明显多于过表达组，差异具有统计学意义（P<0.05）。见图4。

2.4ER-β对人乳癌细胞凋亡的影响

流式细胞术分析显示，正常对照组细胞凋亡率为（4.60±0.46）%，过表达组为（46.57±1.48）%，阴性对照组为（5.20±0.36）%，IL-8干预组为（25.00±3.15）%，4组细胞凋亡率比较差异具有显著性（F=459.50，P<0.05）。正常对照组细胞凋亡率和阴性对照组相比较，差异无统计学意义（P>0.05）;而过表达组明显低于正常对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）;IL-8干预组明显高于过表达组，差异具有统计学意义（P<0.05）。见图5。

2.5 各组细胞Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3蛋白表达比较

蛋白印迹实验结果显示，4组细胞中Bax/Bcl-2、Cleaved caspase-3的表达水平比较，差异具有统[CM）]

计学意义（F=20.67、89.64，P<0.05）。过表达组Bax/Bcl-2、Cleaved caspase-3表达均明显高于正常对照组及阴性对照组，差异均具有统计学意义（P均<0.05）;正常对照组和阴性对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。当转染组细胞加入IL-8培养后，Bax/Bcl-2、Cleaved caspase-3蛋白的表达较过表达组均明显降低，差异均具有统计学意义（P均<0.05）。见图6。

3讨论

目前乳癌病理分类中将ER的状态完全取决于ER-α的表达[8]，但与其结构有一定同源性的ER-β的作用尚不明确。现有研究已证实，大约有30%的TNBC细胞表达ER-β[9]，ER-β能否像ER-α一样成为内分泌治疗靶点值得期待[10]。既往研究报道，ER-β在ER-α存在的情况下发挥抗乳癌细胞增殖的作用，而在ER-α缺失的情况下又发挥促增殖作用[11]。也有研究结果证实，ER-β的激活可在没有配体（雌激素）诱导的情况下，通过诱导胱抑素分泌蛋白家族在TNBC中引发有效的抗癌作用[9]。近期ALEXANDROVA等[12]也在3种TNBC细胞中证实，ER-β1过表达可降低细胞增殖能力，抑制了细胞克隆形成。本研究以TNBC细胞株MDA-MB-231为研究对象，通过上调细胞中ER-β表达来观察其对细胞学行为的影响，结果表明，过表达ER-β后癌细胞出现增殖的抑制、更高的凋亡率以及低迁移率等。这与ALEXANDROVA等[12]研究结果相一致。提示ER-β可能是调控TNBC生物学行为的重要因子，深入研究其下游分子机制具有重要意义。

IL-8是一种炎症趋化因子，在黑色素瘤、肺癌等多种癌症进展中发挥着关键作用[13-16]。已有研究证明，在乳癌中IL-8与其侵袭潜力之间存在正相关[17-19]。既往主要将其归因于IL-8对中性粒细胞的趋化作用所致[20]，而近年研究结果显示，IL-8可通过上调基质金属蛋白酶2或基质金属蛋白酶9的表达和激活PI3K-Akt/MAPK信号通路来增加TNBC细胞的侵袭性[21-22]。在体内模型中，靶向阻断IL-8-CXCR1/2轴可有效阻止癌细胞生长和扩散[23]。有研究报道，化疗期间血浆IL-8浓度越低的病人可获得越高的长期存活率[24]。在一项针对前列腺癌研究中发现，过表达ER-β可抑制炎性因子的表达，进而抑制肿瘤的发展[7]。本研究结果显示，ER-β可通过影响IL-8的表达实现对乳癌细胞生物学行为的调控。ER-β过表达后，IL-8的表达明显降低，线粒体途径凋亡蛋白Bax/Bcl-2、Cleaved caspase-3的表达量增加，从分子水平解释了ER-β过表达后乳癌细胞凋亡率增加的机制。

综上所述，过表达ER-β可以抑制MDA-MB-231细胞中IL-8表达，抑制其遷移并促进其凋亡，这可能为TNBC病人的内分泌治疗提供依据。同时，本研究显示ER-β可抑制癌细胞的增殖，但并非通过调控IL-8通路，其具体分子机制还有待进一步探讨。今后，我们也将在更多的TNBC细胞系中进一步验证该结论的可靠性。

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（本文編辑于国艺）