生理生化法评价黄精属种质资源的耐荫性和抗寒性

蒋宇杰，贾巧君，焦 劼，陈喜良，马存德，常 晖，梁宗锁

（1浙江理工大学生命科学与医药学院/浙江省植物次生代谢调控重点实验室，杭州 310018；2浙江万寿康生物科技有限公司，浙江武义 321200；3陕西步长制药集团公司，西安 710000）

0 引言

黄精是药食两用植物，药用历史悠久，具有补气养阴、健脾、润肺、益肾的功效，临床上用于脾胃气虚、体倦乏力、肺虚燥咳、劳嗽咳血等疾病的治疗[1]。此外，黄精在抗衰老、抗肿瘤、调节免疫力、预防治疗糖尿病等方面具有潜在的药用价值[2]。

黄精喜荫蔽，适合种于荫蔽、半荫蔽环境，因此在种植栽培时需要间作玉米等高秆植物进行遮荫[3-4]。在遮荫弱光条件下，叶片内的叶绿素含量会发生变化，相对低的叶绿素a/b值和高的叶绿素含量能使植物具有较高的光合特性，保持自身的平衡系统，进行正常的生命活动[5-6]。李迎春等[7]以叶绿素、类胡萝卜素含量作为多花黄精的耐荫性指标，研究表明，随着透光率下降，叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b含量均先升高后降低，而叶绿素a/b和类胡萝卜素含量则相反。谷丰收[8]以光合有效辐射降低至600 μmol/(m2·s)时的净光合速率改变幅度作为判断药用植物是否喜荫的依据，发现黄精的净光合速率改变幅度为13.74%，小于15%，为喜荫植物。此外，黄精能耐寒冻，性耐寒，幼苗能露地越冬[9]，但是持续的过低温度会延缓黄精生长发育速度，甚至破坏其生理功能，降低产量、影响品质。贾向荣[10]选用可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸、丙二醛含量作为黄精抗寒性评价指标，发现叶片中可溶性糖含量呈先升高后降低的趋势，而可溶性蛋白与游离脯氨酸含量则呈先降低后升高再降低的趋势，MDA含量先上升后下降。

当前，关于黄精的研究主要集中在黄精的药用成分和药理研究等方面，尽管已有研究对黄精耐荫性、抗寒性指标的选择确定进行了报道，但是对黄精耐荫性、抗寒性种质筛选和鉴定的研究鲜有报道。本研究通过测定黄精叶片中的叶绿素含量及可溶性糖、游离蛋白质、脯氨酸、丙二醛含量，比较不同产地及不同黄精种间、种内的耐荫性和抗寒性差异，并获得耐荫性和抗寒性较强的黄精种质，以期为后续黄精耐荫、抗寒育种提供合适的材料和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

研究田间试验于2014年5月开始、10月结束。田间试验与室内试验均在陕西省略阳县步长集团GAP黄精基地进行。试验地位于陕西省略阳市，属于温暖带湿润季风性气候，试验期间测定的平均气温为20.9℃，最高气温达34.8℃。

1.2 试验材料

试验材料来自陕西省略阳县步长集团GAP黄精基地的黄精种质资源圃，其中多花黄精24份、黄精10份，种质来源详见表1。每个地区共收集黄精根茎100株，并对其进行初步筛选。选择无霉变、大小一致的2年生具休眠芽的根茎，进行统一种植栽培，试验期间定期供水、除草。

表1 种质资源表

UV-2802H型紫外可见分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司），XMTD-8222型恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）。葡萄糖标准品（上海源叶生物科技有限公司，批号：20130115），无水乙醇、丙酮、蒽酮、浓硫酸、冰醋酸等试剂均为国产分析纯。

1.3 耐荫性测定方法

5月黄精出苗后，在隔离带中种植玉米进行遮荫，同年10月结束遮荫处理。遮荫与未遮荫组中，各地区黄精种质各选取20株参与试验。

分别统一采集遮荫前后健康且生长旺盛的黄精植株中部叶片，依次用蒸馏水、去离子水冲洗，用滤纸吸干水分后，备用。准确称取叶片100 mg，转入研钵中，加入预先配制的4.5:4.5:1的无水乙醇、丙酮和蒸馏水混合提取液和少量的石英砂，研磨至匀浆；暗处理2 h后，以提取液为对照，采用紫外分光光度计分别在645、663 nm下测定样品的吸光值，每个样品重复3次。采用Arnon公式[11]计算叶片中叶绿素的含量。

1.4 抗寒性测定方法

各地区黄精种质各选取20株参与试验。分别统一采集长势旺盛黄精植株中带有叶片的茎，依次用蒸馏水、去离子水冲洗，用滤纸吸干水分后，备用。在4℃处理24 h后将材料取出放入冰箱12 h，备用。设3个重复。将叶片分为3份，分别置于密封的自封袋中。测定植物叶片中丙二醛(MDA)含量（硫代巴比妥酸法）[12]、游离脯氨酸(Pro)含量（酸性茚三酮法）[13]、可溶性蛋白含量（考马斯亮蓝G-250染色法）[14]和可溶性糖含量（蒽酮比色法）[15]。

1.5 数据分析

原始数据的整理、单因素方差分析运用Microsoft Excel 2010完成。

采用模糊综合评判法，计算各参试材料测定指标的隶属函数Xn[16]。隶属函数值计算如式(1)；如果指标与耐荫性、抗寒性呈负相关，则采用反隶属函数值计算，如式(2)。叶绿素b、总叶绿素含量与耐荫性呈正相关，叶绿素a含量及叶绿素a/b值与耐荫性呈负相关；可溶性糖、游离蛋白质、脯氨酸含量与抗寒性呈正相关，MDA含量与抗寒性呈负相关。

式中，X为各材料某一指标的测定均值，Xmax为各材料该指标测定值中的最大值，Xmin为该指标中的最小值。将各材料各指标的隶属函数值进行累加，计算其平均值，平均隶属函数值越大种质越优。

2 结果与分析

2.1 遮荫对多花黄精和黄精叶绿素含量的影响

2.1.1 遮荫对多花黄精的叶绿素含量的影响 多花黄精的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量指标的种内变异性大，变异系数均＞20%。遮荫后，除叶绿素a/b值外，其余变异系数增大（表2）。遮荫后，多花黄精叶绿素a含量、总叶绿素呈上升趋势。其中安徽池州、安徽青阳、安徽泾县、广西宜州地区的多花黄精叶片叶绿素a含量、总叶绿素均呈极显著性增加；安徽六安、贵州镇远地区的多花黄精叶绿素a含量显著增加，贵州镇远地区的多花黄精叶片总叶绿素含量显著增加。遮荫后，叶绿素a含量、总叶绿素含量最高的为安徽泾县，分别为2.89、3.92 mg/g，广西宜州次之，含量最低的为江西修水。遮荫后，浙江仙居地区的多花黄精叶绿素a和总叶绿素含量极显著降低；其余地区遮荫前后变化不大。

表2 多花黄精耐荫性指标含量分析及隶属函数值评价

遮荫后，多花黄精种内叶绿素b含量总体略有下降，其中浙江仙居地区的多花黄精叶片叶绿素b含量极显著降低，但安徽池州、安徽青阳、安徽泾县地区的多花黄精叶绿素b含量极显著增加，广西宜州、贵州镇远地区的多花黄精叶绿素b含量显著增加。遮荫后，叶绿素b含量最高的为安徽泾县(1.04 mg/g)，广西宜州次之(1.02 mg/g)，含量最低的为浙江仙居(0.28 mg/g)。

遮荫后，安徽青阳、安徽泾县、江西修水、浙江天台4个地区的多花黄精叶绿素a/b值极显著降低，叶绿素a/b值最小的是江西修水(2.28)，叶绿素a/b值最大的是湖北咸宁(3.36)。其他地区的多花黄精a/b值均增加，其中10个地区的多花黄精a/b值达显著水平，其余不显著。

2.1.2 遮荫对黄精的叶绿素含量的影响 遮荫后黄精叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量的种内变异系数增大，且变异系数均＞20%，而叶绿素a/b值变异系数减少（表3）。遮荫后，黄精叶绿素a含量、总叶绿素总体呈增加趋势。其中陕西略阳、陕西宁强地区的黄精叶绿素a含量、总叶绿素均极显著增加。遮荫后，叶绿素a含量、总叶绿素含量最高的为河南灵宝寺河村，分别为2.46、3.27 mg/g；陕西宁强次之；含量最低的为河南南召，其叶绿素a含量、总叶绿素含量显著降低；其余地区遮荫前后变异不大。

表3 黄精耐荫性指标含量分析及隶属函数值评价

遮荫后，黄精种内陕西宁强地区的叶片叶绿素b含量呈极显著性增加，河南南召、陕西安康地区的叶片叶绿素b含量显著降低，其他地区略有增减，但不显著。遮荫后叶绿素b含量最高的为河南灵宝寺河村、河南灵宝苏村(0.81 mg/g)，陕西宁强次之为(0.79 mg/g)，含量最低的为河南南召(0.40 mg/g)。

遮荫后，除河南灵宝苏村地区的黄精外，其余黄精叶绿素a/b值均有所增加，其中河南鲁山、陕西略阳、陕西安康地区呈极显著性增加。叶绿素a/b值最小的是河南灵宝苏村(2.28)，叶绿素a/b值最大的是陕西安康(3.36)。

2.1.3 多花黄精和黄精的耐荫性分析 由表4可知，未遮荫条件下，多花黄精和黄精间的叶绿素b含量、叶绿素a/b值无显著性差异，而叶绿素a含量存在极显著差异(P＜0.01)，总叶绿素含量存在显著差异(P＜0.05)；遮荫处理后，叶绿素a含量、叶绿素b含量、总叶绿素含量和叶绿素a/b值均无显著性差异。

表4 2种黄精种质资源耐荫性状方差分析

植物的耐荫性是指植物在弱光条件下的生存能力，在遮荫条件下2种黄精的叶绿素a含量、叶绿素b含量、总叶绿素含量、叶绿素a/b值都发生不同程度的变化，因此综合多个指标的隶属函数法评价2个黄精种的耐荫性。多花黄精种内，安徽池州、安徽青阳、安徽泾县、广西宜州、贵州镇远、江西修水地区的种质耐荫性较强，耐荫性综合评定值分别为0.51、0.65、0.63、0.65、0.51、0.52（表2）；黄精种内，河南灵宝寺河村、河南灵宝苏村、陕西宁强地区的种质耐荫性较强，耐荫性综合评定值分别为0.50、0.54、0.51（表3）。总体来看，多花黄精的耐荫性综合评定平均值为0.43，略大于黄精的耐荫性综合评定平均值0.42，两者耐荫性差异小；在所有黄精种质资源中，来自安徽青阳和广西宜州的多花黄精种质耐荫性最优。

2.2 多花黄精和黄精抗寒性分析

2.2.1 抗寒性指标含量分析 由表5可知，2种黄精各抗寒性指标的种内变异性大，变异系数均≥40%。

表5 2种黄精种质资源的抗寒性指标含量分析及隶属函数值评价

多重比较发现，同一种内不同地区的黄精可溶性糖、游离蛋白、脯氨酸、MDA含量存在显著性差异。多花黄精中，可溶性糖、游离蛋白、脯氨酸、MDA含量最高的地区分别是广西宜州(2.06%)、贵州铜仁(7.20%)、浙江仙居(17.07%)、贵州铜仁(52.23%)，约为各对应指标最低含量的10、51、9、25倍。黄精中，可溶性糖、游离蛋白、脯氨酸、MDA含量最高的地区分别是河南灵宝苏村(2.55%)、陕西安康(3.97%)、河南灵宝寺河村(29.41%)、河南灵宝苏村(33.71%)，约为各对应指标最低含量的4、9、9、5倍。此外，黄精的可溶性糖、游离蛋白、脯氨酸、MDA含量平均值均大于多花黄精。

2.2.2 2个黄精种间抗寒性差异分析 由表6可知，在4℃时，多花黄精和黄精间的可溶性糖、游离蛋白、脯氨酸含量无显著性差异，MDA含量存在显著差异。

表6 抗寒性状方差分析

利用隶属函数法综合评价2种黄精的抗寒性强弱。多花黄精种内，云南大理地区的综合评定值最高，为0.56；江西修水、浙江天台分别次之，为0.54、0.53。黄精种内，河南灵宝寺河村的综合评定值最高，为0.62，甘肃陇南次之，为0.55。总体来看，黄精的抗寒性综合评定平均值为0.41，略大于多花黄精的抗寒性综合评定平均值0.38；在所有种质中，河南灵宝寺河村的黄精抗寒性最佳。

3 结论与讨论

遮荫条件下，叶绿素含量的增加和叶绿素a/b的下降是植物对弱光利用能力增强的重要指标[17]。植物叶绿素a对红光的吸收能力强，植物叶绿素b对蓝紫光的吸收能力强，在弱光条件下，植物冠层下部的红光比例较低，因此叶绿素b在荫蔽条件下可捕获更多的光能。梁文斌等[17]研究发现叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量随着遮荫程度的增强而上升，而叶绿素a/b则下降。本研究中，遮荫后总叶绿素含量上升，此结果与已报道研究一致；但遮荫后多数多花黄精和黄精的叶绿素a/b值却上升。杨渺[18]研究发现，随着遮荫梯度的加大，a/b值减小，但在时间尺度上，随着植物对低光环境的适应，叶绿素a/b的比值增加，即在所增加的叶绿素总量中，叶绿素a所占比重大；而且叶绿素a是光合作用中真正的光化学反应场所，这显示了植株对遮荫环境较强的适应能力。王迅等[19]也指出，短期的遮荫叶绿素a/b值会降低，长期的遮荫则会使叶绿素a/b的值增加。因此推测遮荫后黄精叶绿素a/b值的上升与其长时间的遮荫有关。此外，多花黄精的耐荫性略优于黄精的耐荫性，推测原因是多花黄精主要分布于秦岭淮河以南，黄精主要分布于秦岭淮河以北，南部全年的日照时间更短、日照辐射量更小，更适合耐荫植物的生长。刘春涛[20]、陈吉祥[21]、江廷均[22]等指出楠木、魔芋、茶树等耐荫植物，需要较短的日照时长及较弱的光照强度，否则会影响正常的生长。

李富生等[23-25]研究发现，随着温度的降低，游离脯氨酸、游离蛋白、可溶性糖、MDA的含量都相应增加。可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸是细胞内重要的渗透调节物质和营养物质，能增强细胞的保水能力以及起到保护生物膜的作用[26]；MDA含量的增加，表明在低温胁迫时产生了膜脂氧化作用[25]。本研究中，可溶性糖、游离蛋白、脯氨酸含量高且MDA含量低的地区，具有较高的抗寒性综合评定值，符合上述规律。总体上黄精的抗寒性略优于多花黄精的抗寒性，可能是本研究中所用多花黄精来自于安徽、广西、广东、贵州、湖北、湖南、江西、云南、浙江等地，均在秦岭—淮河线以南；而黄精来自于河南、陕西、甘肃等地，分布在秦岭—淮河线以北。秦岭—淮河线以北的地区1月平均气温＜0℃，秦岭—淮河线以南的地区1月平均气温＞0℃，因此主要分布在北方的黄精相比于多花黄精，更能适应低温的环境，拥有更好的抗寒能力。

植物的耐荫性、抗寒性会受到多种因素的影响，不同物种或种质材料对不同指标的响应规律不一定相同，为全面评价植物的耐荫性、抗寒性强弱，隶属函数法可以消除用单一指标鉴定的片面性。根据综合评价结果，安徽青阳、安徽泾县、广西宜州3个地区的多花黄精种质耐荫性最优，可用于选育耐荫性品种；云南大理、江西修水、浙江天台地区的多花黄精和河南灵宝寺河村、甘肃陇南地区的黄精可作为选育抗寒性品种。

运用科学、合理的评价方法筛选黄精优质种质资源，是黄精种质资源研究的核心内容。本研究收集了全国多个地区的黄精种质资源，进行统一种植、规范管理，为后续试验提供材料，同时可对黄精种植的道地性进行研究。种植于略阳GAP基地的各黄精种质，由于环境条件与原产地不同，生长状况各异，广西、贵州、云南、浙江等地区的种质果实未能成熟；滇黄精在当地生长发育周期缓慢。本研究采取多个评价指标，并统一采用隶属度函数法对黄精的耐荫性及抗寒性做出综合评价。对比耐荫性和抗寒性评价结果发现，没有共有的优良种质。试验应选择多类评价指标和评价方法对黄精种质资源进行评价，因此亟需建立一套合理、准确的评价体系。

黄精种质资源库、道地产区的建立能进一步了解黄精，科学合理地栽培黄精。但种质资源信息库建立需要大量的数据与材料，是一项长期的、繁重的工作。此外黄精种质资源的研究应立足于多方向的综合研究，如黄精多糖、黄酮、皂苷等物质的活性研究，黄精重要代谢通路中基因的表达及功能研究，黄精功能食品和保健食品的研发等。