红景天胶囊调控BDNF信号通路的抗抑郁作用机制研究*

高丽丽 吴成翰 廖远生 张 胜 赵 坚

抑郁症是一种主要表现为持久的情绪低落的精神类疾病，其已成为全球突出的健康问题[1]，对中国民众健康及社会危害正日益凸显。抑郁症的病因及发病机制复杂，至今仍未完全阐明，有待进一步深入研究。因此，探讨抑郁症的发病机制，寻找更加有效的治疗药物，对防治抑郁症的发生发展具有重要的意义。抑郁症发病机制复杂是现代医学抗抑郁疗效不理想、易复发和服药周期长的主要原因。故对于不良作用小的中成药开发与研究成为目前的热点[2]。中药抗抑郁作用具有多层次、多靶点的特点，被广泛用于抑郁症的治疗。

抑郁症属于中医“郁证”范畴，郁证起于七情刺激，继而由气及血，气血不足，心神失养，脑神不利而发为郁病。心主血，心藏神，气血调和，则心神安定，红景天益气养心在抑郁症的中药组方中属于高频药物。胡国恒教授自拟肾脑复元汤，方中重用红景天，对卒中后抑郁起到了很好的抗抑郁作用[3]。中成药心脑欣胶囊、利舒康胶囊是抑郁症的有效药物，两方的君药均为红景天[4，5]。课题组前期研究发现以红景天苷为主要成分的红景天胶囊运用于抑郁症临床治疗已获得显著的疗效，其不良作用也并未因剂量增大而增多[6，7]。但目前对于红景天胶囊抗抑郁的作用机制尚未见相关报道。

本研究选用慢性不可预见性温和应激抑郁大鼠模型，给予红景天胶囊干预，基于“心主神明，脑为元神之府”，从脑源性神经营养因子(BDNF)信号通路探索其抗抑郁的分子机制，为中医药抗抑郁治疗提供理论基础。

1 材料

1.1 动物本研究采用清洁级2～3个月龄(体质量180～250 g)健康雄性无特定病原体(Specific pathogen free，SPF)级Sprague Dawley(SD)大鼠。大鼠适应性饲养7 d。实验步骤和实验动物的照料均严格按照2006年中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》[8]标准进行。大鼠自由饲养1周后，除正常组以外其余所有大鼠制备慢性不可预知性温和应激抑郁模型(CUMS)。

1.2 药物红景天胶囊(西藏高原安生物科技开发有限公司，0.3 g/粒，批号: 2020301)；舍曲林片(浙江京新药业股份有限公司，规格：50 mg，批号：A20120501)。

1.3 试剂RNAiso Plus(9109)、PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)(RR036A)、SYBR © Premix Ex TaqTM II(TliRNaseH Plus，RR820A)，大连宝生物工程有限公司。

1.4 仪器Centrifuge TDL-5高速低温离心机，上海安亭科学仪器厂；MJ-Mini 48 孔梯度 PCR 仪，美国伯乐公司；Real-Time PCR Syste(StepOnePlus)，美国应用生物系统公司；BW-OF302 旷场实验视频分析系统，上海软隆科技发展有限公司。

2 方法

2.1 动物分组及给药随机取20只健康SD大鼠为正常对照组。将造模成功的80只雄性抑郁症SD大鼠按随机数字表法随机分为4组，分别为：模型组；舍曲林组；红景天胶囊低剂量组；红景天胶囊高剂量组。给药前用1 ml蒸馏水配制混悬液，给药剂量按实验动物与人的体表面积比，人与大鼠等效药量换算方法计算，大鼠的等效剂量相当于人的6倍，灌胃给药。正常组每日灌服生理盐水1 ml，模型组每日灌服生理盐水1 ml，舍曲林组按10 mg/kg制备舍曲林混悬液1 ml，红景天胶囊低剂量组按30 mg/kg制备红景天胶囊混悬液1 ml，红景天胶囊高剂量组按60 mg/kg制备红景天胶囊混悬液1 ml。以上药物均每日上午灌服1次,连续干预4周。

2.2 造模方法制备CUMS抑郁模型，应激刺激包括：束缚2 h，潮湿垫料24 h，禁食24 h，夹尾倒挂30 min，禁水24 h，45 ℃倾斜鼠笼24 h，冰水游泳6 min，明暗颠倒，空笼饲养12 h。正常组不进行任何刺激。其余各组进行每天随机不同顺序的刺激，共刺激30 d，且不得连续使用相同顺序刺激，同一种刺激顺序使用次数要小于3次，实现不可预知性的刺激方式。CUMS处理完成后，获得80只抑郁症大鼠。

2.3 指标检测

2.3.1 糖水偏爱率实验实验前，先训练大鼠进行适应性含糖饮水。第1天，放2瓶均装有1%的蔗糖水；第2天，1瓶装有1%的蔗糖水，1瓶纯水；最后1 d，将蔗糖水的瓶子和纯水的瓶子调换位置，减少干扰，持续12 h；接着，再禁食禁水持续12 h后，测定动物糖水偏好实验。将1瓶100 ml的1% 蔗糖水与1瓶100 ml纯水置于每笼大鼠前，观察12 h，对2瓶水进行称量，记录糖水消耗体积、纯水消耗体积，得出大鼠糖水偏好指数。糖水偏好率=糖水消耗量/(糖水消耗量+纯水消耗量)×100%。造模前后和给药4周后各进行1次糖水偏好实验，计算大鼠糖水偏好率。

2.3.2 旷场实验采用四周及底面全部为黑色的无盖方箱，其底面分成16个20 cm×20 cm的白线方格。先将大鼠放置于暗箱中，适应2 min后，记录大鼠 5 min 内的活动情况。观察指标：水平运动得分:以大鼠穿越底面格数(至少3爪进入方格)为水平运动得分，每格得1分；垂直运动:以大鼠前两肢直立次数为垂直运动得分，每直立1次得1分。测定后用酒精消毒擦拭箱子内部，避免气味残留。记录造模前后和给药4周后各组大鼠的旷场得分情况。

2.3.3 强迫游泳使用圆柱形玻璃缸测定强迫游泳实验，玻璃缸高20 cm，直径14 cm，深度约10 cm。实验前1 d，先对大鼠进行游泳训练，随后吹干放回笼中，第2天再进行正式实验。实验时大鼠在玻璃缸中游泳6 min，记录最后5 min内大鼠的累积不动时间。不动时间判定为大鼠仅有细小肢体动作，无挣扎动作，头部浮于水面。记录造模前后和给药4周后各进行强迫游泳试验。

2.3.4 血清CREB BDNF表达水平测定血清样本收集选取股动脉方式采集大鼠血液，置于EP管中，静置30 min，在4 ℃，3500 r/min 离心15 min，分离血清并分装，置于-80 ℃冰箱保存。

2.3.5 海马组织中CREB BDNF GSK-3β mRNA表达水平测定按照 SYBR © Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseHPlus)试剂盒说明书步骤完成qRT-PCR 实验，以明确大鼠海马组织中CREB、BDNF和GSK-3β的mRNA 表达水平，引物序列见表 1，在PCR 管中加入反应液，涡旋离心，再将反应液置于管底；设置的扩增程序为95 ℃、30 s，1个循环；95 ℃、5 s；60 ℃、30 s；40个循环；95 ℃、15 s；60 ℃、60 s；95 ℃、15 s。应用 Step One Software V 2.1 分析软件调整基线和阈值后，分析反应板数据，得出每个样品的 Ct值，与对照组比较后，取2ΔΔCt值进行数据统计。

表1 PCR 引物序列

3 结果

3.1 对抑郁大鼠糖水偏爱率的影响造模前各组糖水偏爱率差异无统计学意义。造模后，与正常组比较，各组抑郁大鼠糖水偏爱率显著降低。药物干预后，与模型组相比，治疗4周后红景天胶囊低剂量组、舍曲林组及红景天胶囊高剂量组的糖水偏爱率均增加，差异具有统计学意义，红景天胶囊干预组与舍曲林组作用相当。见表2。

表2 红景天胶囊对各组大鼠糖水偏爱率的影响 (只，

3.2 对抑郁大鼠旷场实验运动得分的影响造模前各组大鼠旷场实验运动得分差异无统计学意义(P>0.05)。造模后，与正常组比较，各组抑郁大鼠旷场实验水平运动得分显著降低，垂直运动得分也显著降低。药物干预后，与模型组比较，治疗4周末，舍曲林组、红景天胶囊低剂量及高剂量组水平运动及垂直运动得分均上升。红景天胶囊干预组与舍曲林组作用相当。见表3。

表3 红景天胶囊对大鼠旷场实验运动得分的影响 (只，

3.3 对抑郁大鼠强迫游泳不动时间的影响造模前各组大鼠强迫游泳实验得分差异无统计学意义(P>0.05)，造模后，与正常组比较，各组抑郁大鼠强迫游泳实验不动时间显著增高。药物干预后，与模型组比较，治疗2周后，舍曲林组、红景天胶囊低剂量组和红景天胶囊高剂量组大鼠强迫游泳不动时间明显减少，红景天胶囊干预组与舍曲林组作用相当。见表4。

表4 红景天胶囊对各组大鼠强迫游泳不动时间结果

3.4 对抑郁大鼠血清BDNF CREB GSK-3β的影响经药物干预后，与模型组相比，红景天胶囊低剂量组、红景天胶囊高剂量组及舍曲林组的血清BDNF、CREB含量均增加，且红景天胶囊高剂量组增加最为显著，各药物干预组GSK-3β含量均下降，以红景天胶囊高剂量组下降最为显著。见表5。

表5 红景天胶囊对抑郁大鼠血清BDNF CREB的影响

3.5 对抑郁大鼠海马BDNF CREB GSK-3β mRNA的影响经药物干预后，与模型组相比，舍曲林组、红景天胶囊低剂量组及红景天胶囊高剂量组的BDNF、CREB mRNA表达均显著升高，其中以红景天胶囊高剂量组升高更为明显。GSK-3β mRNA表达均显著下降，以红景天胶囊高剂量组下降更为显著。见图1，表6。

表6 红景天胶囊对大鼠海马BDNF CREB GSK-3β mRNA表达的影响

图1 各组大鼠海马组织中BDNF CREB GSK-3β mRNA的表达

4 讨论

红景天性味：寒，甘、涩。归经：心、肺经。临床上其具有理气养血、益气养心、扶正固本、活血化瘀等功效。临床上多用于气虚血瘀、胸痹心痛、中风偏瘫、倦怠气喘等症。早在《黄帝内经》就提出心是情志活动的重要器官，主宰地位着精神活动，《素问·灵兰秘典论》曰：“心者,君主之官，神明出焉”，也认为心对于精神活动的主宰调节作用至关重要。虽脑为元神之府，但心神对脑神有重要的支配作用，正如《素问遗篇·本病论》曰：“心为君主之官，神明出焉，神失守位，即神游上丹田，在帝太一帝君泥丸宫下”。心精气汇聚于脑，支配人的精神行为。现代研究也证明中医学中“心主神明”实质是心脏对“精神-神经-内分泌-靶器官”的整体概况，体现了中医的五脏整体观念[9]。心脏支配大脑对外界做出反映，并形成意识思维等情感活动[10]。

中医临床实践也表明，从“心”论治很多精神神志疾病，也取得了良好的效果，这又为心主神明供了临床实践的证据[11]。脑为髓海，髓由精生，精源于五脏六腑之气血。脑为人体生命活动的中枢，神明之心实质就是脑。心主血，上供于脑，故心脑相系，常心脑同治。人的精神、意识和思维活动是大脑对外界事物的反映。因此基于“心主神明、脑为元神之府”，本研究从脑源性神经营养因子(BDNF)入路，对红景天胶囊治疗抑郁症的机制进行研究，也为中医学探索益气养心法治疗抑郁症奠定初步实验基础，也为红景天胶囊的临床应用奠定理论基础。

脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是体内一种神经营养因子，具有促进神经元的生长和分化的重要作用，在神经元细胞的生长及功能可塑调节作用中发挥重要作用，影响着中枢神经可塑性[12]。研究表明[13]，抑郁小鼠模型的脑内BDNF表达较正常小鼠明显下降，且经抗抑郁药物治疗后BDNF表达回升。究其机制可能与BDNF相关信号通路损伤有关，而此信号通路也是抑郁症发病的关键通路[14，15]。BDNF信号系统的启动程序是受体酪氨酸激酶B(TrkB)的磷酸化，TrkB受体结合BDNF后可启动糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)信号通路[16]。GSK-3β信号通路是近年来研究抗抑郁药作用机制的重要靶标，是细胞内重要的信号转导通路之一[17]。环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)是重要的核转录因子之一，在脑内所有细胞中均有表达。BDNF与TrkB相结合，使TrkB磷酸化，从而激活GSK3β途径，促使BDNF表达相关的转录因子CREB丝氨酸位点磷酸化，最终上调BDNF的表达[18]。综上所述，BDNF/GSK-3β/CREB通路是抑郁症发生的关键通路，是抑郁症机制研究的重点。

通过本实验研究发现，红景天胶囊可有效发挥抗抑郁的作用，且其通过调节BDNF/GSK-3β/CREB通路而发挥抗抑郁作用，保护海马神经元的功能,为今后对抗抑郁药物机制的深入研究奠定理论基础。