基于肠肾轴理论探讨中药序贯式结肠透析对CKD大鼠肠道菌群的影响*

张 然 张雪琴 张晓艳 郭 鸿 郭阿霞 孙 茹 牛春兰

慢性肾脏病(Chronic kidney disease，CKD)是各种原因引起的肾脏结构和功能障碍≥3个月，包括肾小球滤过率(Glomerular filtration rate，GRF)正常和不正常的病理损伤、血液或尿液成分异常，及影像学检查异常；或不明原因的GRF下降(<60 ml/min)超过3个月[1]。有学者对中国CKD的流行病学进行了一个横断面研究，发现中国成年人群CKD的患病率为10.8%，由此推测中国CKD的人数为1.195亿[2]。中药序贯式结肠透析是近年发展起来治疗CKD的方法之一，其配合现代医学常规治疗，可减轻早中期慢性肾功能衰竭患者的临床症状[3]。因其价廉、方便易操作、适用范围广、安全等优势，越来越被重视[4]，并开始在中医院推广应用。近年来，越来越多的证据显示，肠道菌群失调(Intestinal microbes dysbiosis)是CKD患者进展至尿毒症的高危因素之一[5]。2011年，Meijers等[6]首次提出了肾脏与肠道相互作用的“肠-肾轴(Gut-kidney axis)”学说。在此基础上，2015年，Pahl等[7]提出“慢性肾脏病-结肠轴(Chronic kidney disease-colonicaxis)”概念。本研究主要探讨中药序贯式结肠透析对CKD大鼠肠道菌群的影响，进一步明确中药序贯式结肠透析治疗CKD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级SD大鼠40只，雄性，2个月龄，体质量(180±20)g，合格证号：SCXK-(军)2007-004，购自军事医学科学院实验动物中心。在山西中医药大学实验室饲养，保持室温在 18～25 ℃、相对湿度为(50%～60%)，采用人工12 h 昼/夜循环照明环境中用全价营养、分笼饲养。每日按时清洗笼舍，保证大鼠能自由摄食及饮水。

1.2 仪器 试剂和药物恒温培养箱：(36±1)℃，美国Themo公司，型号Model 311；超净工作台：苏州苏净有限公司，型号 SW-CJ-2FD；混匀仪：大龙兴创实验仪器(北京)有限公司，型号 MX-S；冰箱：中科美菱，型号 YCD-EL259A；天平：精度 0.01 g，梅特勒-托利多有限公司，型号ME1002；纯水仪：Thermo 公司，MicroPure UV/UF；四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)；高效液相色谱仪(Agilent1100，Agilent，日本)。

1.3 5/6肾切除肾纤维化大鼠模型的建立实验时大鼠10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔麻醉后，俯卧位固定于鼠台上。大鼠备皮，75%乙醇消毒。从距左肋骨下缘、脊柱旁开 l.5 cm处皮肤做一纵向切口，长约 1.5 cm，逐层分离筋膜、腹内外斜肌筋膜、进入后腹膜腔，分离脂肪层，暴露左侧肾脏，钝性分离脂肪囊，小心剥离肾包膜及肾上腺，注意避免损伤肾上腺，动脉夹夹闭左侧肾蒂，切掉左肾上、下极2/3 肾实质，明胶海棉压迫创面止血，去掉动脉夹观察30～50 s后无继续出血，小心将残肾还纳入腹腔，逐层缝合肌层、皮下及皮肤，局部消毒。1周后切去右肾，麻醉及手术过程相同，即制备成5/6肾切除大鼠模型。

1.4 分组给药将40只SD雄性大鼠按Excel生成的随机数字表法随机分为正常组(10只)、模型组(10只)、中药序贯式结肠透析组(10只)、阳性对照组(10只)。正常组大鼠正常条件饲养，不造模；其余各组大鼠制备成5/6肾切除大鼠模型。造模8周检测大鼠Scr、BUN 水平，检测造模情况。

正常组、模型组均予每天灌胃1次生理盐水；阳性对照组给予盐酸贝那普利5 mg/kg·d药液灌胃，每天1次；中药序贯式结肠透析组予以阳性对照组基础治疗上加中药序贯式结肠透析。结肠透析液方药为自拟肾衰肠疗方:生大黄30 g，大黄炭15 g，煅龙骨30 g，煅牡蛎30 g，土茯苓30 g，蒲公英30 g，附片6 g，丹参15 g，五倍子10 g，芒硝10 g。每周3次，12次为一个疗程。

药物给药共干预15 d，中药序贯式结肠透析组在停止西药后，继续透析至疗程结束，处死大鼠。腹主动脉采血后摘除左肾，回肠内容物、肝、肾、脾、淋巴结放入液氮保存以检测相关指标。

1.5 指标检测

1.5.1 一般情况观察小鼠进食、饮水量、精神状况、皮毛变化及活动情况，每周测量小鼠体质量与24 h尿量、饮水量。

1.5.2 血液中代谢毒素水平相关指标检查收集血液，检测血清中血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、血尿酸(UA)、内生肌酐清除率(Ccr)、尿肌酐(Ucr)水平。

1.5.3 IS与PCS检测大鼠于受试前后空腹采取静脉血，分离血清，-80 ℃低温冰箱冻存待用，高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱(HPLC-ESI-MS/MS)法测定血清 PCS、IS。IS标准品(纯度99.2%，Sigma-Aldrich公司，美国)，PCS标准品(纯度 99.8%，Sigma-Aldrich公司，美国)。

2 结果

2.1 一般情况给药结束后，与正常组比较，模型组大鼠精神状态较差，体质量显著降低(P<0.05)，24 h尿量、饮水量显著增加(P<0.05)，出现多饮、多尿情况；与模型组比较，各治疗组大鼠的精神状况均有一定改善，阳性对照组和结肠透析组大鼠体质量显著升高(P<0.05)、24 h饮水量、尿量显著减少(P<0.05)；与阳性对照组相比，中药序贯式结肠组大鼠24 h饮水量、尿量显著减少(P<0.05)，提示中药序贯式结肠透析可以改善CKD大鼠多尿症状。见表1。

表1 各组大鼠一般情况测定结果比较 (只，

2.2 代谢毒素水平变化与正常组比较，模型组大鼠24 h血清中SCr、BUN、UA水平均显著升高(P<0.05)，Ucr、Ccr水平显著降低，这与CKD患者后期代谢毒素水平变化相一致；与模型组比较，各给药组大鼠血清中SCr、BUN、UA水平均显著降低(P<0.05)，Ucr、Ccr水平显著增高(P<0.05)，这提示贝那普利与中药序贯式结肠均可以下调CKD大鼠体内代谢毒素的水平；与阳性对照组相比，中药序贯式结肠组大鼠血清中BUN、UA水平均显著升高(P<0.05)，Ucr、Ccr水平显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠代谢毒素水平测定结果比较 (只，

2.3 血清中IS与PCS变化与正常组比较，模型组大鼠血清中PCS、IS 含量均显著升高(P<0.05)；与模型组比较，中药序贯式结肠透析组大鼠血清中PCS、IS 含量均显著降低(P<0.05)；与阳性对照组相比，结肠透析组大鼠血清中PCS、IS含量均显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清中IS与PCS测定结果比较

3 讨论

中药保留灌肠是由张仲景“蜜煎导法”逐渐完善和发展而来，对延缓肾衰进程具有显著优势，已有报道称中药灌肠可以对肠道菌群起到调节作用，罗学文[8]发现中药肾衰方灌肠组大鼠的大肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳杆菌均有改变; 邹川等[9]发现予中药大黄复方灌肠治疗慢性肾衰2周后，患者粪便培养可见大肠杆菌菌落计数较治疗前明显减少，总厌氧菌菌落计数、双歧杆菌、乳杆菌菌落计数较治疗前均明显增加。由于中药序贯式结肠透析由中药灌肠发展而来，其弥补了传统中药保留灌肠的不足，将中医与现代技术相结合，仿腹膜透析原理，经弥散和渗透，清除血中毒素，有效保护残余肾功能、延缓肾衰进程。

有研究显示，中药序贯式结肠透析技术中所选的中药众多，有大黄，当归，黄芪、蒲公英、牡蛎等；生大黄、六月雪、槐角等[9-11]。本实验选择山西中医药大学附属医院肾病科科室多年临床总结的有效经验协定方剂肾衰灌肠方，来验证该技术对肠道菌群的影响。

蛋白结合类毒素与尿毒症患者多器官损害密切相关，其中IS、PCS是蛋白结合类毒素的典型代表。此类毒素在CKD患者体内的蓄积能加重肾脏病，并可导致多系统疾病，如神经系统疾病、心血管疾病、肾性骨病等，严重影响患者生存率及其生活质量[12]。据报道，在CKD 3～5期，血清IS、PCS 浓度与CKD呈明显负相关，肾功能下降可导致以上毒素的明显升高[13]。IS、PCS可通过激活RAS系统、诱导细胞因子、增强氧化应激等机制加速肾功能恶化[14]。PCS主要由肠道厌氧菌产生，将食物中的苯丙氨酸、酪氨酸转变为4-羟基苯乙酸，再脱羧为对甲酚，大量对甲酚经由肠道黏膜吸收，在肠道上皮细胞经磺基转移酶转化为PCS。PCS主要通过肾小管基底膜侧的有机阴离子转运体转运至肾小管管腔，经尿液排出。IS主要在肠道中产生，食物中的色氨酸经大肠杆菌分解产生吲哚，后者经门静脉吸收入肝脏，再经过羟化、硫酸化而产生IS。血液中IS也是主要通过肾小管有机阴离子转运体分泌、排泄[15]。由于 IS、PCS主要由肠道产生，理论上可以通过改变肠道菌群降低IS、PCS浓度。本研究发现中药序贯式结肠透析可以降低血清IS、PCS 浓度，考虑与其延缓肾衰竭作用与增加IS、PCS分泌排泄有关,需要进一步研究。

近年来，对于中药灌肠对肠道菌群的影响研究逐渐增多，邹川等[9]研究发现经大黄复方制剂灌肠治疗后，肠道菌群明显改善，表现为大肠杆菌菌落计数明显减少，双歧杆菌、乳杆菌菌落计数明显增加; 肠道屏障功能的改善，D-乳酸和内毒素水平明显降低。姬卫国等[16]对慢性肠炎肠道菌群与中药联合抗生素灌肠疗效研究显示，中药辨证施治联合抗生素灌肠可显著改善不同证型肠道菌群失调及大便常规指标，提高中医证候疗效，其机制可能与调节肠道菌群有关，本研究结果表明，应用中药序贯式结肠透析技术能有效下调CKD大鼠的代谢毒素水平，尤其可减少肠源性尿毒素BUN、UA 的吸收或增加其排出，从而改善肾功能，延缓肾衰竭的进展。