大豆重组自交系群体芽期耐盐性状加性与上位性QTL定位

滕卫丽，付 雪，刘 冀，张翔超，史飞飞，王 博，董莹莹，赵 雪，韩英鹏，李文滨

(东北农业大学大豆研究所，大豆生物学教育部重点实验室，农业农村部东北大豆生物学与遗传育种重点实验室，哈尔滨 150030)

大豆作为粮饲兼用作物，具有丰富油脂和蛋白。但面对国内巨大消费市场，国产大豆产量不足，需依赖进口弥补空缺。大豆产量受多种环境因素影响，其中盐胁迫是影响大豆产量重要的非生物胁迫之一。盐胁迫影响种子萌发和植株生长，降低大豆产量和品质[1-3]。随着土壤盐渍化问题加重，提升作物耐盐性，是缓解作物减产的有效途径，也是未来开拓耕种面积，保障大豆供需平衡的基本条件[4]，因此培育耐盐大豆品种迫在眉睫。

植物耐盐性是由多个基因共同作用的复杂性状，目前学界已在大豆耐盐分子育种方面开展研究，并检测到多个耐盐QTL。Lee等用S-100和To⁃kyo杂交衍生的F2:5群体作QTL定位，在大豆3号染色体上鉴定出1 个主效QTL 位点，位于Sat_091 和Satt237 之间[5]，与Hamwieh 和Ha 等定位到的大豆耐盐QTL 位点相同，但并未将耐盐基因从中分离出来[6-8]。直至Guan等利用Tiefeng 8和85-140构建的F5:6群体进行精细定位，缩小QTL 区间，发现该区间内仅有1个基因（Glyma03g32900）[9]。

耐盐相关QTL 位点在其他染色体上分布情况相关报道较多。Chen 等通过室内和田间试验，共同定位到1个位于18号染色体上Sat_164和Sat_358之间QTL位点[10]。姜静涵利用NY36-87和Peking构建F2:3群体，通过苗期耐盐性鉴定，将耐盐QTL 定位在18 号染色体，SSR 标记18-7 和18-8 之间约240 kb区间上[11]。Kan等利用由184个F7:11代家系组成的RIL群体作QTL定位，在8号染色体上定位到1 个QTL 位点Sat_162，此前获得候选基因Gly⁃ma08g12400.1 位置相近[12-13]。Tuyen 等利用耐盐品种Fiskeby Ⅲ和中度盐敏感品种Williams 82 杂交获得含有132 个单株的F2群体，在13 号染色体上定位到1 个新QTL，位于Gm13_37204738 ～ Gm13_38988256[14]。刘谢香利用中黄39和NY27-38杂交构建包含142 个家系的RIL 群体，开展苗期耐盐性QTL 定位，位点qS-6 和qS-14 分别位于标记06-0935～06-1000和14-1377～14-1421之间[15]。Zhang等利用以Kefeng 1和Nannong 1138-2杂交构建F7:11RIL群体QTL定位结果，通过211个栽培大豆组成的种质资源群体得到的GWAS 结果相结合，确定GmCDF1（Glyma.08g102000）为重要候选基因[16]。

以上耐盐研究主要针对大豆苗期，对于芽期研究较少。在大豆生长过程中，需首先确保大豆在盐渍土中正常发芽，再考虑是否正常生长甚至提高产量[17]。同时结果表明大豆各时期耐盐性之间无直接关联，因此应加强大豆芽期阶段耐盐研究[18]。

本研究利用母本东农46 和父本L-100 构建的F2:12（2019年）和F2:13（2020年）世代含有127 个家系的重组自交系群体为试验材料，评价其芽期耐盐相对吸胀率、相对发芽指数和相对发芽率并作QTL定位分析，探索大豆芽期耐盐分子机制，为土壤盐渍化条件下大豆出苗、全苗、壮苗提供有力保障，同时也为培育大豆耐盐品种，加快分子辅助育种提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究利用东农46（♀）和L-100（♂）构建的F2:12（2019年）和F2:13（2020年）世代含有127 个家系的重组自交系群体为材料。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

每个家系设置对照组：蒸馏水（0 mmol·L-1，C）处理，处理组：NaCl（150 mmo·L-1，S）处理，每组3次重复。芽期耐盐鉴定参考李亚凯方法[19]。

1.2.2 芽期耐盐性状鉴定

芽期耐盐性状鉴定指标计算公式如下[19]：

式中，M1-种子干重；M2-暗培养24 h后种子重量；Gt-发芽试验第n天发芽数；Dt-发芽试验第n天；CK为对照组材料吸胀率、发芽率和发芽指数；E为处理组材料吸胀率、发芽率和发芽指数。

1.2.3 构建大豆遗传连锁图谱

本研究所用遗传连锁图谱由东北农业大学大豆研究所大豆分子设计及全基因组编辑实验室构建[20]。共得到4 004 个标记，图谱覆盖20 条染色体，全长3 672.52 cM，其中11 号染色体最长，为286.25 cM；12号染色体最短，为126.29 cM；10号染色体标记数最多为295个，17号染色体标记数最少为124个；最大图距为27.73 cM，最小图距为0.60 cM。

1.2.4 表型数据分析

利用Microsoft Excel（2021）处理F2:12（2019年）和F2:13（2020年）世代127 个家系芽期耐盐性状表型数据。利用SPSS 25和R软件作统计分析。

1.2.5 QTL分析

利用QTL IciMapping 4.1.0.0 软件对大豆RIL 群体F2:12和F2:13世代3 个相对盐害指数作QTL 定位分析。加性效应分析方法为ICIM-ADD，上位性效应分析方法为ICIM-EPI，设定LOD 阈值分别为＞2.5和＞5。QTL 命名标准为：q+相对吸胀率、相对发芽指数、相对发芽率英文缩写（STIR、STGI 和STGR）+相对应染色体序号+相应染色体上出现QTL顺序[20]。

2 结果与分析

2.1 耐盐性状表型分析

2.1.1 耐盐性状表型分布特点

对F2:12和F2:13世代籽粒作芽期耐盐发芽试验并分析相关表型数据。结果表明，处理组平均值均小于对照组平均值，且各性状处理组与对照组间存在显著差异（见表1）。在亲本和RIL 群体中，芽期耐盐性状表型数据如表2所示。在F2:12世代中，3个相对盐害指数：相对吸胀率（STIR）、相对发芽指数（STGI）和相对发芽率（STGR）平均值分别为0.08、0.24 和0.08，变化范围分别为-0.77～1.00、-1.92～1.00 和-2.25～1.00。而在F2:13世代中，3 个相对盐害指数平均值分别为0.06、0.51和0.26，变化范围分别为-0.32～0.38、-0.60～1.00和-0.90～1.00。

表1 RIL群体耐盐性状表型数据处理和年份间方差分析Table 1 Phenotypic data processing and analysis of variance between years for salt tolerance traits in RIL populations

表2 亲本及RIL群体耐盐性状表型数据分析Table 2 Phenotypic data analysis of salt tolerance traits in parents and RIL population

母本东农46 相对吸胀率、相对发芽率和相对发芽指数均小于父本L-100，相对盐害指数越小，越耐盐，因此母本耐盐性高于父本，二者存在明显差异。在两个世代中，相对吸胀率、相对发芽率和相对发芽指数变化幅度均超出亲本，所以在3个耐盐性状中均存在超亲家系。除F2:12世代相对吸胀率峰度偏高外，其他世代及性状均在合理范围内，偏度绝对值除F2:12世代相对发芽率外，在其他世代及性状中均小于1。

大豆RIL 群体芽期耐盐性状相对盐害指数频率分布直方图见图1～3，结果表明，3 个相对盐害指数数据在F2:12和F2:13世代中均呈正态或偏正态分布，具有数量性状遗传特点，因此适合QTL分析。

图1 RIL群体相对吸胀率频率分布直方图Fig.1 Frequency distribution of relative swelling rate of RIL population

图2 RIL群体相对发芽指数频率分布直方图Fig.2 Frequency distribution of relative germination index of RIL population

图3 RIL群体相对发芽率频率分布直方图Fig.3 Frequency distribution of relative germination rate of RIL population

2.1.2 耐盐性状表型相关性分析

本研究分析F2:12和F2:13世代芽期耐盐性状（吸胀率、发芽指数和发芽率）及其3 个相对盐害指数表型相关性（见图4和5）。在F2:12和F2:13世代极显著正相关关系中，对照组吸胀率与处理组吸胀率间相关性均最高，相关系数分别为0.92 和0.96；在F2:12和F2:13世代极显著负相关关系中，处理组发芽率与相对发芽率间相关性均最高，相关系数分别为0.55和0.73。

图4 F2:12世代RIL群体耐盐性状表型相关分析Fig.4 Phenotypic correlation analysis of salt tolerance traits from F2:12 of RIL population

图5 F2:13世代RIL群体耐盐性状表型相关分析Fig.5 Phenotypic correlation analysis of salt tolerance traits from F2:13 of RIL population

2.2 耐盐性状QTL定位

2.2.1 耐盐性状加性QTL定位

利用ICIM-ADD 方法对F2:12世代耐盐性状相对吸胀率、相对发芽指数及相对发芽率作加性QTL定位，在3 个性状中均检测到相应QTL（见表3）。定位到2个控制相对吸胀率QTL位点qSTIR-1-1和qSTIR-16-1，位于1 和16 号染色体上，贡献率分别为11.55%和13.96%，加性效应分别为-30.97 和-14.83，表现为负调控作用，控制相对吸胀率等位基因均来自父本L-100。定位到1 个控制相对发芽指数的QTL 位点qSTGI-2-1，位于2 号染色体上，贡献率为10.11%，加性效应为20.02，表现为正调控作用，控制相对发芽指数等位基因来自母本东农46。定位到3 个控制相对发芽率QTL 位点qST⁃GR-16-1、qSTGR-16-2 和qSTGR-18-1，分别位于16、16和18号染色体上，贡献率为9.90%、7.63%和7.09%，加性效应为-27.29，-34.85 和-19.29，表现为负调控作用，控制相对发芽率等位基因均来自父本L-100。

利用ICIM-ADD 方法对F2:13世代耐盐性状3 个相对盐害指标作加性QTL定位，定位到5个控制相对吸胀率QTL位点和1个控制相对发芽率QTL位点（见表3）。控制相对吸胀率QTL 位点qSTIR-4-1、qSTIR-7-1、qSTIR-9-1、qSTIR-10-1 和qSTIR-19-1 分别位于4、7、9、10 和19 号染色体上，贡献率分别为4.88%、6.28%、15.91%、8.01%和10.95%，其中qSTIR-4-1、qSTIR-7-1、qSTIR-10-1 和qSTIR-19-1 加性效应分别为3.00、3.34、3.78 和4.36，表现为正调控作用，qSTIR-9-1 加性效应为-5.53，表现为负调控作用，说明东农46携带的qSTIR-4-1、qSTIR-7-1、qSTIR-10-1和qSTIR-19-1等位基因及L-100携带的qSTIR-9-1等位基因可控制相对吸胀率。控制相对发芽率的QTL 位点qSTGR-20-1 位于20 号染色体上，贡献率为12.23%，加性效应为17.37，表现为正调控作用，控制相对发芽率的等位基因来自母本东农46。

表3 F2:12和F2:13世代RIL群体耐盐性状加性QTLTable 3 Additive QTL for salt tolerance traits in the F2:12and F2:13 generations of RIL population

2.2.2 耐盐性状上位性QTL定位

利用ICIM-EPI方法对F2:12世代耐盐性状3个相对盐害指数作上位性QTL定位（见图6）。检测到96对控制相对吸胀率QTL 位点，贡献率为0.55%～1.65%；6 对控制相对发芽指数QTL 位点，贡献率为7.83%～11.77%；2 对控制相对发芽率QTL 位点，贡献率为5.01%～5.18%。在这些QTL 位点中，相对吸胀率和相对发芽指数QTL 效应值正负不同，其中62 对QTL 位点效应值为正值，即上位效应为亲本型大于重组型，40 对QTL 位点效应值为负值，即上位效应为重组型大于亲本型；相对发芽率QTL 效应值皆为负值，即上位效应为重组型大于亲本型。加性qSTIR-16-1 位点与5 个位点存在互作效应，这5 对上位性互作QTL 为：16-16、16-17、16-18、16-19 和16-20，说明该位点通过直接和与其他位点互作两种方式调控相对吸胀率。

利用ICIM-EPI方法对F2:13世代耐盐性状3个相对盐害指数作上位性QTL 定位（见图6）。检测到3对控制相对发芽指数QTL位点，贡献率为16.71%～20.32%；检测到1对控制相对发芽率QTL位点，贡献率为26.59%。在4对QTL位点中，QTL效应值均为负值，即上位效应为重组型大于亲本型。

图6 F2:12和F2:13世代RIL群体耐盐性状上位性QTLFig.6 QTL for supernumerary salt tolerance traits in F2:12 and F2:13generation of RIL populations

3 讨论与结论

芽期对大豆耐盐非常重要[21]，主要通过吸胀和发芽两个过程萌发出苗，可通过其中3个相关指标（吸胀率、发芽率和发芽指数）鉴定大豆芽期耐盐性。在低盐条件下，大豆种子萌发延缓，在高盐条件下，发芽率下降，且活力下降程度比萌发程度大，说明盐对种子活力的危害大于萌发率[22]。本研究所选亲本东农46 和L-100 在相对吸胀率、相对发芽指数和相对发芽率上均存在显著差异，为利用其杂交衍生的RIL 群体挖掘大豆芽期耐盐QTL，开展分子辅助育种奠定基础。

本研究利用IciMapping 4.1.0.0 软件，对F2:12和F2:13世代RIL 群体芽期3 个相对盐害指数作QTL 分析，共检测到12 个加性QTL，贡献率为4.88%～15.91%，其中贡献率最高QTL 位点分别为qSTIR-9-1（15.91%）、qSTGI-2-1（10.21%）和qSTGR-20-1（12.23%）。在F2:12世代中定位到的相对吸胀率QTL（qSTIR-16-1）和相对发芽率QTL（qSTGR-16-1）部分区间重合，说明存在一因多效作用，即在Block5374到Block5380区间同时控制相对吸胀率和相对发芽率。在F2:12世代中定位到的2 个相对发芽率QTL（qSTGR-16-1 和qSTGR-16-2）在Block5425到Block5429 区间重合，其中qSTGR-16-1 在16 号染色体Block5328 到Block5439 区间，包含李亚凯定位到控制相对发芽指数和相对发芽率的SNP 位点AX-93856062[19]。在F2:13定位到的相对吸胀率QTL（qSTIR-7-1）位点在Block2253 到Block2254 区间内，陈华涛等研究发现大豆耐盐基因GmHKT6；2（Glyma.07G130100）位于该区间内[23]，同时该位点还包含于Chen等定位到QTL位点qtrM.1的Satt702-Satt728 区间内[24]。由此可知，以上2 个QTL 位点（qSTGR-16-1 和qSTIR-7-1）可靠性较高，为进一步进行耐盐基因精细定位奠定基础。本研究还发现10个新QTL位点，其中贡献率最高位点为qSTIR-9-1（15.91%），这些新位点对大豆芽期耐盐遗传研究方面具有重要参考价值。

本研究共检测到108对与大豆芽期耐盐相关上位性互作QTL，贡献率为0.55%～26.59%，其中2对上位性QTL，即调控相对发芽指数性状的7-16和调控相对发芽率性状的4-8，贡献率较高，分别为20.32%和26.59%，且加性qSTIR-16-1位点也出现在上位性互作对中，同时与5个位点存在互作效应，说明在大豆芽期耐盐复杂基因网中QTL 之间加性×加性上位性互作也发挥重要作用。因此可将基因表达及调控网络作为解析大豆芽期耐盐遗传机制突破口，研究这5 对互作QTL 之间遗传机制，挖掘大豆芽期耐盐相关基因。