奶粉功能化石墨烯的制备及其用于药物载体研究

周婷荣， 宋蔓婷， 罗思宇， 邓 睿， 杨志国， 渠陆陆， 杨国海

(江苏师范大学化学与材料科学学院，江苏徐州 221116)

石墨烯是一种独特的二维薄膜材料，由密集堆积的碳原子以sp2的杂化方式排列成平面六边形蜂窝状网格结构。2004年，英国曼彻斯特大学Novoselov等[1]用微机械剥离法，成功从石墨中分离出石墨烯。石墨烯独特的结构决定了其具有较好的物理和化学性质，在光学、电学、热学和机械以及其他方面都表现出优异的性能[2 - 5]。石墨烯的制备方法一般包括:微机械剥离法、液相剥离法、化学气相沉积法、氧化还原法和自下而上合成法[6 - 12]等多种方法。目前最常用的是剥离石墨氧化物的化学还原法，它的成本较低而且可以实现大规模的制备。石墨烯具有疏水性，且石墨烯纳米片之间存在强烈的范德华力[13]，使其趋向于团聚甚至重新形成石墨，但石墨烯的一些独特性质是与它的单层结构密切相关的[14]，因此防止石墨烯纳米片的团聚，使其保持单层的结构是合成高质量石墨烯的关键因素。在以往的合成当中，通常利用功能化试剂通过共价或非共价作用来防止石墨烯的团聚[15 - 17]。制备过程中一般使用水合肼等还原剂，通常具有毒性和腐蚀性，影响了它在生物医学方面的应用。近年来，科研工作者在研究采用环境友好的方法制备石墨烯等领域取得了一定的进展。如利用葡萄糖、明胶、牛血清白蛋白等作为还原剂，同时不需要其它功能化试剂，得到稳定分散的石墨烯溶液[18 - 21]。另一方面，各种碳纳米材料凭借其独特的物理化学性质，成为了生物医药分析领域的研究热点。相比于其它材料，碳纳米材料容易穿过细胞膜等特点[22]，使其成为一种理想的药物载体。氧化石墨烯纳米片作为石墨烯的一种衍生物，表面修饰了含氧等官能团，增加了其亲水性和生物相容性，在药物传输等领域的研究取得了一定的进展。而石墨烯由于疏水性的特点，其在生理缓冲体系条件下的稳定性较差，限制了其在相关领域的应用[23 - 26]。因此，寻找新的既可做还原剂又可做稳定剂的物质，建立绿色合成石墨烯的方法，提高其生物相容性，使其可达到更高的药物负载量，实现药物的高效运输和可控释放，具有重要的意义和广阔的应用前景。

已有报道将半胱氨酸、天冬氨酸等氨基酸用于石墨烯的制备[27,28]，但是所得产物在水或缓冲溶液中容易团聚，限制了其进一步应用。奶粉廉价易得，环境友好，其主要成分之一蛋白质，含有多种氨基酸残基等还原性官能团[29]，同时有大量的π-π共轭结构和疏水作用赋予其一定的吸附性[30]，可以有效防止纳米片团聚。在这些特性的共同作用下，奶粉具有既作还原剂又可作稳定剂的潜力，可用于石墨烯的制备并应用于生物医学研究。本文通过一种简便的方法合成了奶粉功能化的石墨烯纳米片(mp-GNS)，并证实了其具有良好的生物相容性和稳定性。另外，以罗丹明6G(R6G)为抗癌药物模型，考察了mp-GNS对R6G的吸附和释放行为。结果表明mp-GNS/R6G对R6G的释放具有pH响应和缓释作用，因此，mp-GNS有望成为一种新型的抗癌药物递送载体。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

原子力显微镜(AFM)图在Agilent 5500仪器上，SPI3800控制器，采用轻敲模式获得；透射电子显微镜(TEM)在JEOL 2100仪器上进行分析，操作电压为200 kV；扫描电子显微镜(SEM)在HitachiS-4800型仪器上获得照片；X-射线粉末衍射(XRD)的测定在Shimadzu XRD -6000衍射仪上进行；紫外-可见光谱(UV-Vis)图采用UV-3600(日本)紫外-可见分光光度计进行测量；MTT法中的吸光度使用Bio-Rad680酶标仪(美国)在490 nm进行测定。

石墨粉、H2SO4(98%)、KMnO4、NaNO3、H2O2(30%)、HCl、BaCl2和二甲亚砜购自南京试剂有限公司。阿霉素(DOX)、磷酸盐缓冲溶液(PBS)购自Sigma-Aldrich。细胞培养液3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)购自上海生工生物工程有限公司，其它均为分析纯试剂。实验所用去离子水通过Millipore Autopure系统得到。

奶粉(雀巢脱脂成人奶粉)购自当地超市。

1.2 氧化石墨烯(GO)的合成

采用Hummers的方法[31]合成GO。将250 mL圆底烧瓶浸入冰水浴中，向烧瓶中加入浓H2SO4、4 g石墨粉和2 g NaNO3的混合物。在剧烈搅拌的同时，向悬浮液中分多次添加12 g KMnO4(小心控制加入速率)，反应过程中温度始终保持在20 ℃以下。在不断搅拌下将溶液升温至40 ℃。随着实验的进行溶液逐渐变稠，呈现棕灰色，气泡逸出的速率明显下降。35 min后，边搅拌边缓慢加入约180 mL去离子水，有大量气泡逸出，经过20 min后，显棕色。接着加入H2O2至溶液呈亮黄色。在溶液保持余热的时候过滤，得到一个黄棕色的滤饼，用5%的HCl和去离子水洗涤，从而制得GO。

1.3 mp-GNS的制备

将10 mL 0.5 mg/mL剥离的GO加入盛有30 mL去离子水的圆底烧瓶中，充分搅拌均匀，加入1 g奶粉，滴加NaOH溶液调节pH至中性，升温至80 ℃搅拌30 min使其混合均匀。将混合物在油浴环境下保持95 ℃恒温加热搅拌6 h。将得到的黑色反应溶液冷却至室温，经过多次离心洗涤后，备用。

1.4 R6G的负载和释放

为了将荧光探针R6G装载在mp-GNS上，先将R6G和不同量的mp-GNS溶液分别混合，室温振荡反应2 h，离心洗涤后，用荧光光谱仪测量上清液中R6G的荧光强度变化，根据计算得到饱和吸附量。为了研究R6G从mp-GNS/R6G复合物上的释放过程，将饱和吸附的mp-GNS/R6G复合物，加入到不同pH的缓冲溶液或无水乙醇中。在37 ℃振荡不同的时间，离心分离后，用荧光光谱仪测定上清液中荧光强度的变化，研究不同pH条件下复合物上R6G的释放行为。

1.5 细胞毒性和药物运输

将DOX与不同量的mp-GNS溶液分别混合均匀，在室温下振荡2 h，离心10 min后，在480 nm激发波长下，于500～700 nm波长范围内测定上清液中DOX的荧光光谱，确定DOX的饱和吸附量。将得到的mp-GNS/DOX复合物在超声辅助下重新分散到水中，于4 ℃下保存，备用。

细胞增长的抑制通过MTT实验获得。即在96孔板中接入100 μL 1.0×104cells/孔的MCF-7细胞溶液，接着加入一系列浓度梯度的mp-GNS、DOX和mp-GNS/DOX，分别培养24 h和48 h。通过噻唑蓝方法验证细胞存活情况，为了保证实验的准确性，需要重复4次。对照实验在其他条件都相同时，以5 μL MTT(5 mg/mL)代替复合物，在对照孔中培养4 h，然后离心10 min。保留滴液，接着在每个孔中加入二甲基亚砜，于振荡培养箱中充分振荡后，用酶标仪在波长570 nm下测量得光强度值，通过计算得到细胞相对存活率。

2 结果与讨论

2.1 mp-GNS的表征

本实验由Hummer法制得GO，然后以奶粉为还原剂和稳定剂得到石墨烯，如图1所示。反应过程中，奶粉释放出还原性的自由电子，然后自由电子对GO进行还原。反应的最终产物为CO2和H2O等无毒无害小分子，同时未反应的奶粉以及氧化得到的有机小分子均安全无毒且容易通过水洗除去。

图1 mp-GNS的制备示意图Fig.1 Illustration of the green synthesis of mp-GNS

图2(A)中曲线a为GO的吸收曲线，在231 nm处出现吸收峰，是C=C的π-π*跃迁，另外300 nm处的肩峰是由于C=O的n-π*跃迁，表明生成了GO；曲线b为mp-GNS的吸收曲线，通过奶粉还原GO之后，吸收峰由231 nm红移至267 nm处，而267 nm处的吸收峰说明GO被还原成了石墨烯，这是由于石墨烯的大π键恢复导致的；同时300 nm左右处的肩峰消失，则进一步说明含氧官能团被除去[32]。

图2(B)和2(C)分别是对mp-GNS纳米片通过AFM进行的形貌的表征和厚度分析图。mp-GNS的厚度明显比纯石墨烯纳米片的理论值要厚[16]，这是由于奶粉吸附到石墨烯纳米片上导致mp-GNS的厚度有所增加，mp-GNS呈片层状结构，片层间距增大。说明奶粉的修饰有效阻止了石墨烯的团聚，拉开了层间距，因此mp-GNS具有较好的分散性和稳定性。

如图2(D)所示，通过对mp-GNS纳米片的TEM进行形貌表征分析，可以观察到mp-GNS呈半透明薄纱状，纹理清晰，表面存在一些褶皱，但没有发生团聚。表明奶粉均匀牢固地附着在石墨烯片层上，保持了mp-GNS的稳定性。

如图2(E)所示，当石墨被氧化后，在2θ=10.04°处出现了GO的晶面衍射峰，表明生成了氧化石墨晶体结构。当氧化石墨掺杂奶粉并还原后，在2θ为10.4°处的衍射峰消失，并在2θ为24°左右处出现新的衍射峰，表明GO被还原成了石墨烯[15]。石墨烯的衍射峰变宽，强度减弱，主要是由于奶粉的加入阻碍了石墨烯片层团聚现象的产生，制备成较多为单层结构的石墨烯，使其层间距增加，而导致衍射现象不明显[33]。

同时，为了探究石墨烯纳米片在各种环境下的稳定性，将GO和mp-GNS分别在水和PBS中于室温下培养24 h。通过图2(F)和2(G)可以看出，GO在水中呈现出较好的分散性和稳定性，但在PBS中发生了严重的团聚；而mp-GNS在水中和PBS中都表现出好的分散性和稳定性，且在观察时间内无任何团聚现象。这就说明奶粉吸附到石墨烯表面形成mp-GNS，有效改变了石墨烯纳米片表面的疏水性，使纳米片不易发生团聚，且在缓冲溶液环境下能够长时间的保持稳定。

图2 (A)GO(a)和mp-GNS(b)的紫外-可见吸收光谱图;(B)mp-GNS的AFM图；(C)厚度分析图；(D)TEM图像;(E)GO(a)和mp-GNS(b)的XRD谱图;(F)GO和mp-GNS(G)在水和PBS中的稳定性比较Fig.2 (A) UV-Vis absorption spectra of GO (a) and mp-GNS (b);(B) AFM image of mp-GNS；(C) Cross-section analysis along with the line in AFM image of mp-GNS;(D) TEM image of mp-GNS;(E) XRD patterns of GO (a) and mp-GNS (b);(F) Dispersibility of GO and mp-GNS (G) in water and PBS

2.2 R6G的负载和释放

为了研究mp-GNS作为药物载体的作用，选择R6G作为荧光探针对mp-GNS进行标记。R6G是一种阳离子染料，而mp-GNS呈电负性，它们通过静电作用吸引在一起，形成mp-GNS/R6G复合物，如图3(A)所示。实验通过检测mp-GNS的不同加入量在550 nm下对R6G的荧光猝灭来监控整个负载过程。随着mp-GNS加入量的增加，上清液中的荧光强度逐渐减小，为激发态的R6G和mp-GNS表面之间发生共振能量转移从而导致的荧光猝灭，说明了R6G已经负载在mp-GNS上[34]。在mp-GNS加入量为100 μL时，R6G达到了饱和吸附量。通过计算，R6G的吸附容量为85 μg/mg。R6G在mp-GNS上具备高度负载能力可以归因为mp-GNS具有较高的比表面积，以及R6G与mp-GNS之间存在强烈的π-π共轭作用和氢键相互作用[35]。

进一步研究了mp-GNS/R6G在不同pH缓冲溶液中的释放性行为。释放的R6G由于远离mp-GNS，不再发生荧光共振能量转移，因而R6G荧光得到恢复[36]。如图3(B)所示，R6G在不同pH值时都经历了一个持续释放的过程，并且在开始阶段释放速度较快，几乎与时间呈指数型关系，后面释放速度趋于平缓。但是在不同的pH值下R6G的释放量不同。在pH=7.4时，R6G的释放速度很慢，10 h只释放了约20%，40 h后释放量为27%。而pH=4.6和pH=2.0时，10 h内R6G的释放量分别达到32%和50%，之后R6G的释放量随时间的增加而缓慢减少。这表明在相同的时间内，酸性条件下R6G的释放量要远远高于中性条件下的释放量。

图3 (A)mp-GNS(1.0 mg/mL)的加入量(a-j：0，10，20，30，40，50，60，80，100，120 μL)对R6G(4 μg/mL)的荧光光谱；(B)mp-GNS/R6G在pH=2.0、4.6和7.4下的释放量；(C)mp-GNS/R6G在乙醇(a)和水溶液(b)中的荧光光谱Fig.3 (A)Fluorescence spectra of R6G solution (4 μg/mL) with increasing amounts of mp-GNS with a concentration of 1.0 mg/mL (from a to j:0,10,20,30,40,50,60,80,100,120 μL) using the excitation wavelength of 350 nm;(B) R6G release profiles for mp-GNS/R6G measured in PBS at pH 2.0,4.6 and 7.4 at 37 ℃;(C) Fluorescence spectra of mp-GNS/R6G in ethanol (a) and water (b)

为了分析在不同极性溶液中mp-GNS/R6G的释放行为，以乙醇为介质进行了实验。如图3(C)所示，结果发现mp-GNS/R6G在水溶液中发生荧光猝灭现象(b)，经过乙醇处理后溶液荧光强度得以恢复(a)。荧光猝灭现象表明R6G和mp-GNS之间除了静电引力和氢键相互作用之外，还存在着强烈的π-π共轭作用，而荧光强度的恢复则说明用乙醇处理之后，R6G和mp-GNS之间的氢键发生了解离，使得R6G在乙醇中的溶解度要远远高于在水中的溶解度，导致R6G在乙醇中能很好的释放却很难负载到mp-GNS表面。细胞中富含有机化合物如多糖，蛋白质和脂质等，它们可以诱导mp-GNS/R6G解离，使其荧光得以恢复。这种诱导释放过程证明mp-GNS是一种在细胞内能够承担运输作用的绝佳材料[37]。

2.3 药物负载和传输分析

为了评估mp-GNS对真实药物的运载能力，将DOX负载在mp-GNS上，制备得到mp-GNS/DOX复合物，利用与mp-GNS/R6G类似的方法考察其饱和吸附量。图4(A)所示为不同mp-GNS加入量对DOX的荧光猝灭结果，产生最大DOX荧光猝灭的mp-GNS的体积为100 μL，此时DOX恰好在mp-GNS上达到饱和吸附。通过计算，DOX的吸附容量是170 μg/mg。

为了考察mp-GNS的细胞毒性，将MCF-7细胞分别与不同浓度梯度的mp-GNS溶液于37 ℃下分别培养24 h和48 h，然后用MTT测定相对细胞活力(图4(B))。结果表明，所制备的mp-GNS对细胞的毒性较低，且具有良好生物相容性，有望成为一种药物输送的理想纳米载体。

以游离的DOX和mp-GNS/DOX溶液作对比，如图4(C)所示，在相同条件下，mp-GNS/DOX的毒性要低于DOX，这与mp-GNS/DOX上DOX的释放过程有关。当细胞内吞作用发生之后，DOX逐渐从mp-GNS/DOX上释放出来，表现出缓释效果，表明奶粉在药物释放过程中起到了调节作用。由于所得物质可以控制药物在胞内的释放速度，使药物在一定时间内维持稳定的水平，因此具有较好的临床治疗效果前景。

图4 (A)mp-GNS(1.0 mg/mL)的加入量(a-j：0，10，20，30，40，50，60，80，100，120 μL)对DOX(8 μg/mL)的荧光光谱；(B)不同浓度的mp-GNS对MCF-7细胞毒性的影响；(C)DOX和mp-GNS/DOX对MCF-7细胞毒性的影响Fig.4 (A) Fluorescence spectra of DOX solution (8 μg/mL) with increasing amounts of mp-GNS with a concentration of 1.0 mg/mL (from a to j:0,10,20,30,40,50,60,80,100,120 μL) using the excitation wavelength of 350 nm;(B) Relative cell viability of MCF-7 cells treated with different concentrations of mp-GNS after 24 h and 48 h incubation;(C) Cytotoxicity of free DOX and mp-GNS/DOX to MCF-7 cells after 24 h and 48 h incubation

3 结论

本文采用一种简单绿色的合成方法，以廉价易得的奶粉为功能化试剂，成功制备了mp-GNS。奶粉有效发挥了还原的作用，同时作为稳定剂防止了石墨烯纳米片的团聚。结合石墨烯大的比表面积和良好的生物相容性等特点，mp-GNS可被用于药物传输研究。药物吸附实验结果表明，mp-GNS对R6G具有较好的吸附容量，同时mp-GNS/R6G对R6G的释放具有pH响应性和缓释作用。另外，细胞实验表明，制备的mp-GNS毒性低，可以作为一种理想的载体用于细胞内的药物运输、生物成像等其他方面。随着研究的不断深入，将还原效果好且绿色的还原剂用于石墨烯的功能化已成为研究趋势。本工作为制备高生物相容性和水溶性的石墨烯的合成和应用开辟了新的道路，具有重要的意义。