纳米多孔高熵合金Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3类酶活性研究及其对抗坏血酸的检测

闫飞虹， 李玲芸， 周 行,3， 黄岩松， 崔荣静*

(1.苏州大学材料与化学化工学部，江苏苏州 215000；2.常熟理工学院材料工程学院，江苏常熟 215500；3.河北师范大学化学与材料科学学院，河北石家庄050024)

抗坏血酸(Ascorbic Acid，AA)又名维生素C，它是生物体内最为重要的抗氧化剂之一，在生物体的各种生理、病理活动，如抗氧化损伤、神经保护、神经元细胞功能调控、干细胞增殖以及抗坏血病等过程中起着极为重要的作用[1 - 3]。人体不能自我合成AA，只能通过饮食获取，很多水果蔬菜，如猕猴桃、冬枣、青椒都富含AA。AA也作为抗氧化剂被广泛应用于食品加工、制药制剂、动物饲料、复合维生素片以及化妆品中[4,5]。因此，开发用于灵敏可靠检测AA的简便分析方法至关重要。

相比天然酶，纳米酶由于其优越的性能受到了广泛的关注[6,7]。到目前为止，已经有类过氧化物酶、类氧化物酶、类过氧化氢酶、类超氧化物歧化酶等多种纳米酶被开发[8 - 11]。其中，类过氧化物酶由于其在分析检测和医疗诊断中的广泛应用而备受关注[12,13]。金属纳米酶材料以贵金属为主，包括金、银、铂、钯以及这些金属的合金材料。高熵合金(HEAs)包含5个或5个以上的主元素，元素具有相似的原子比例[14]，具有功能属性和结构属性。纳米多孔高熵合金(NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3)具有三维双连续的纳米多孔结构，有较高的孔隙率，高比表面积，高导电率和高稳定性。通过探究NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3的类酶活性，发现该材料具有类过氧化物酶特性，NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3介导的催化反应可以短时间产生大量信号分子。应用NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3来检测AA，AA与TMB相比，会优先与H2O2发生氧化还原反应，从而在相同时间内延缓了TMB的开始氧化时间和最后的氧化程度[15]。基于以上研究，建立了一种检测AA的简便方法，该方法操作简易、灵敏度高。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TU-1901双光束紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；KKQ-50E超声波清洗仪(昆山禾创超声仪器有限公司)；EL204电子分析天平(梅特勒托利多仪器(上海)有限公司)；EVO18扫描电子显微镜(德国，ZEISS公司)；Tecnai G220s-TWIN透射电子显微镜(美国，FEI公司)；HH-2数显恒温水浴锅(金坛江南仪器厂)；GDJ500C电弧熔炼单旋系统(沈阳科友真空技术有限公司)；pHS -3C酸度计(上海雷磁仪器厂)。

Pt、Pd、Au、Ag、Ru、Al(99.9%，吉林东北有色金属有限公司)；NaAc、HAc(分析纯，江苏强盛化工有限公司)；30%H2O2、HCl、NaOH、抗坏血酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)≥99%(GC)、5%Nafion(Sigma-Aldrich公司)；无水乙醇(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)。实验用水为超纯水。

1.2 NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3材料的制备

按物质的量比Pt∶Pd∶Au∶Ag∶Ru∶Al=3∶3∶3∶3∶3∶85，称量金属块Pt、Pd、Au、Ag、Ru、Al(99.99%)，将金属块表面仔细打磨后放入样品腔。在Ar气氛保护下经电弧熔炼高频加热融化，运用电磁搅拌器搅拌熔融态的液态合金，当液态金属发生转动，说明熔炼完成，等合金完全冷却，为了保证纯度，每个样品在Ar保护下至少还要再熔炼4次，经过熔体快淬得到Pt3Pd3Au3Ag3Ru3Al85合金条带，最后将合金条带置于5%HCl中，于50 ℃恒温水浴锅下腐蚀48 h，制得纳米多孔高熵合金(NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3)。

1.3 NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3使用前处理

将10.0 mg NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3分散于0.05%的Nafion溶液中，使其质量浓度为5 mg/mL,用前超声处理20 min,使材料分散均匀。

1.4 检测方法

依次向离心管中加入适量的0.1 mol/L HAc-NaAc缓冲溶液(pH=4.0)、NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3、H2O2、AA 和TMB溶液，总体积3 mL,使NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3、H2O2、TMB质量浓度分别为20 μg/mL、500 μmol/L、300 μmol/L，AA浓度范围是0.5～150 μmol/L。将混合液放在40 ℃水浴锅中反应10 min后冰水浴5 min，然后将溶液置于TU-1901紫外分光光度计中，测量波长652 nm处的吸光度。

1.5 实际样品前处理

21金维他多维元素片购于当地药房。称取1 g药片，研磨成细粉后，置于16 mL的HAc-NaAc缓冲溶液(pH=4.0)中，超声溶解10 min。然后将样品溶液离心(13 000 r/min),取上层清液，用于实际样品中AA的检测。

2 结果与讨论

2.1 NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3的扫描电镜和透射电镜表征

通过扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)表征，揭示了制得的NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3的形态。有趣的是，NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3具有类似小花的形态，从SEM图可以看出，材料已经形成了三维贯通的孔隙结构。而从TEM图中可看出材料内部的晶格条纹呈明暗交替、均匀分布，证明形成了多孔形貌。

图1 NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3的(A、B)扫描电镜(SEM)图和(C、D的透射电镜)(TEM)图Fig.1 SEM images (A，B) and TEM images (C，D) of the NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3

2.2 NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3的X射线衍射和能谱分析

NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3的X射线衍射(XRD)图和能谱(EDS)图见图2。从图2(A)可以看见，脱合金后的NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3一些复杂的衍射峰消失，出现了三个明显的衍射峰，这可能是由于六元高熵合金脱合金后形成难以区分的物相。其中标准卡片为：Pt(JCPDS 04-0802),Pd(JCPDS 46-1043)，Au(JCPDS 04-0784)，Ag(JCPDS 87-0720)，Ru(JCPDS 88-2333)和Al(JCPDS 85-1327)。与纯Pt标准卡片对比，(111)、(200)和(220)晶面高熵合金的特征峰在2θ=39.76°、46.24°、67.45°。由于NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3中原子半径较大元素的掺杂，使NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3衍射峰向小角度偏移。从图2(B)可以看出，在EDS图中，Pt3Pd3Au3Ag3Ru3Al85六元高熵合金条带被酸腐蚀后，形成了与之前不同的相，而且被腐蚀后铝含量明显降低，直接证实了大部分的Al被腐蚀掉，与SEM图中观察到的基本一致，表明较成功制备了NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3催化剂。

图2 NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3的X射线衍射(XRD)图(A)和能谱(EDS)图(B)Fig.2 XRD patterns (A) and EDS (B) of the NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3

2.3 NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3的类酶活性研究

2.3.1 pH值对高熵材料催化活性的影响图3(A)为吸光度和pH值的关系曲线，可见在pH为4.0时吸光度最大，即在相对酸性环境中，NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3具有较高的催化活性。因此，将pH=4.0作为后续反应的最佳pH值。

2.3.2 温度对高熵材料催化活性的影响由图3(B)可知，反应体系吸光度随温度升高而增大，当温度为60 ℃时，体系吸光度最大。但是当温度高于40 ℃时，AA本身不太稳定，而且由图可知，在40 ℃时，体系吸光度并不低。因此，选择40 ℃为后续实验温度。在图中还可以看出，在40～70 ℃区间内，材料仍具有很好的催化活性，证明NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3在较宽的温度范围内具有较高的催化活性，这拓宽了它的实际应用范围。

2.3.3 高熵材料浓度对其催化活性的影响由图3(C)可知，模拟酶质量浓度达到20 μg/mL时,吸光度趋于平稳，因此在接下来的实验中，模拟酶NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3的浓度皆为20 μg/mL。

图3 pH(A)、温度(B)和NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3浓度(C)对NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3类过氧化物酶催化活性的影响Fig.3 Effect of pH (A)，temperature (B) and concentration of NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3 (C) on the peroxidase -like activity of the NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3

2.3.4 底物为H2O2时高熵材料的表观Km值图4(A)是TMB浓度对NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3催化活性的影响。由图可知，体系吸光度随着TMB浓度增大而增大，后面趋于平缓。实验选择TMB的浓度为300 μmol/L。图4(B)为H2O2浓度对NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3催化活性的影响。由图可知，体系吸光度随着H2O2浓度的增大而增大，其变化规律符合Michaelis-Menten动力学理论。实验选择H2O2的浓度为500 μmol/L。图4(C)为NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3模拟酶对TMB底物的Lineweaver-Burk线性拟合图，可得NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3对TMB的米氏常数Km=0.213 mmol/L。图4(D)为NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3模拟酶对H2O2的Lineweaver-Burk线性拟合图，可得NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3对H2O2的米氏常数Km=0.197 mmol/L。该米氏常数较小，说明H2O2对NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3亲和力较强。

图4 NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3对TMB(A)和H2O2(B)的米氏曲线图；NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3对TMB(C)和H2O2(D)的Lineweaver-Burk线性拟合图。其中(A)和(C) H2O2浓度固定为500 μmol/L，改变TMB浓度；(B)和(D)TMB浓度固定为300 μmol/L，改变H2O2浓度Fig.4 Steady-state kinetic assys for NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3.(A) The concentration of H2O2 was 500 μmol/L and TMB concentration varied;(B) The concentration of TMB was 300 μmol/L and H2O2 concentration varied;(C) and (D) the corresponding Lineweaver-Burk plots of the double reciprocal of the Michaelis-Menten equation

2,3.5 米氏常数对比同样，在相同反应条件下测得HRP对TMB和H2O2底物的稳态动力学常数。Km值越小，表明酶对底物的亲和力越强。由表1可知，NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3模拟酶比HRP对TMB和H2O2底物的亲和力强，这是由于NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3模拟酶可以提供多个催化活性位点[16]，而HRP分子只可以提供一个反应活性位点。

表1 表观Km值比较

2.4 NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3比色检测抗坏血酸

图5(A)是AA浓度和吸光度的关系曲线，AA浓度为0.5～150 μmol/L，吸光度随AA浓度的增大而变小，AA浓度到150 μmol/L时,吸光度接近于0，说明此时TMB还没有参与氧化还原反应。由图5(B)可以得出，体系检测AA的检出限(S/N=3)为0.09 μmol/L，其线性范围为0.5～60 μmol/L。与其他材料相比(表2)，以NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3构建的比色传感器检测AA具有更低的检出限。

图5 (A) AA浓度和吸光度的关系曲线；(B) AA在0.5～60 μmol/L浓度范围内的线性曲线Fig.5 Typical absorption profiles of TMB in the presence of different concentration of AA

表2 其他材料对抗坏血酸检测的比较

2.5 抗干扰性测试

为了证明NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3-TMB-H2O2体系比色检测AA具有优越的抗干扰能力，将一些物质，如K+、Ca2+、Cl-、尿酸(UA)、丙酮(Ace)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ace)、葡萄糖(Glu)加入体系中，检测他们的响应。如图6所示，与空白样品相比，加入其他物质，体系在波长652 nm处的吸光度稍稍有变化，而加入AA后，体系在652 nm处吸光度急剧下降。说明上述物质对AA的检测基本不产生影响，NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3-TMB-H2O2体系可以选择性比色检测AA。

图6 干扰物质存在时NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3-TMB-H2O2体系的紫外-可见光谱(K+，Ca2+，Cl-，UA，Ace，Gly，Ace，Glu，AA在体系中浓度都为100 μmol/L)Fig.6 UV-Vis spectra of NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3-TMB-H2O2 system in the presence of some common interference substances (K+,Ca2+,Cl-,UA,Ace,Gly,Ace,Glu,AA with a concentration of 100 μmol/L,respectively)

2.6 实际样品检测

在21金维他多维元素片样品溶液中进行回收实验，探讨了以NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3为基础构建的灵敏比色传感器在实际样品分析中的应用。经计算,该比色传感器的回收率介于97.8%～100.9%之间,表明该方法构建的传感器可用于实际样品中的AA的检测。

表3 21金维他多维元素片样品检测结果

3 结论

本文采用脱合金法合成了纳米多孔高熵合金(NP-Pt4Pd4Au4Ag3RuAl3)。探究发现该材料具有很好的类过氧化物酶催化活性，在较宽的酸碱和温度范围内都具有较高的催化活性。利用高熵合金材料的类过氧化物酶特性，采用比色法检测AA，其检出限为0.09 μmol/L。该方法灵敏度高、操作简易，可应用于AA的实际检测。