基于网络药理学预测畲药小香勾治疗痛风性关节炎相关潜在作用靶点和信号通路

林小惠， 汪余嘉， 聂雪坤， 张立， 林敏华， 艾克拜尔·热合曼， 陈子春

痛风性关节炎(gout arthritis，GA)是尿酸结晶沉积于关节及其周边软组织导致的炎性代谢性风湿疾病[1]，以关节红肿热痛为主要症状，并伴有不同程度的活动功能障碍。如未及时治疗，可能损伤关节，严重时还会发生肾结石甚至肾衰竭，影响患者的生活质量。目前，治疗急性GA常用的一线药物包括秋水仙碱、非甾体类抗炎药(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)及糖皮质激素等，虽然疗效较为明确，但毒副作用多，耐受性低，复发率高。

小香勾为桑科植物条叶榕(FicuspandurataHance var.angustifoliaCheng)或全叶榕(FicuspandurataHance var.holophyllaMigo)的干燥根及茎，系畲族习用药材，常用于关节疼痛、风湿痹痛及痛风等疾病[2]。现代临床研究也表明，小香勾治疗GA具有较好的临床疗效，显著降低了急性GA的发作次数和药物不良反应发生率[3-4]，但其作用机制及物质基础尚不明确。

网络药理学是一门建立在“疾病-靶点-基因-药物”多层次网络基础上的新兴学科，已广泛应用于药物靶点预测及药理机制研究[5]。网络药理学的研究理念与中药多成分、多靶点的特点相适应，为研究中药活性成分相关作用靶点或信号通路提供了有利的技术支持。因此，本研究基于网络药理学，深入挖掘畲药小香勾治疗GA的潜在作用靶点和相关信号通路，以期为小香勾的深入研发提供基础理论依据。

1 资料与方法

1.1 小香勾活性成分和作用靶点预测 由于小香勾系畲族特有习用药材，TCMSP及TCMID等常用中药数据库未收录小香勾，因此本研究主要通过文献检索获得其主要活性成分的相关信息[6]。小香勾对GA的抗炎镇痛作用主要与以下6种活性成分相关：佛手柑内酯(bergapten)、毛地黄黄酮(luteolin)、补骨脂素(psoralen)、芦丁(rutin)、羟基香豆素(7-Hydroxycoumarin)及绿原酸(chlorogenic acid)。通过Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库收集上述活性成分的PubChem Cid、二维和三维结构图。由于上述活性成分在TCMSP数据库中收录的潜在作用靶点较少或未收录，因此主要通过Pharmmapper数据库(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)对活性化合物进行药效团模型靶点预测，收集小香勾相关活性成分的作用靶点。

1.2 疾病相关靶点的获取 基于GeneCards(https://www.genecards.org/)，OMIM(http://www.omim.org/)，TTD(http://bidd.nus.edu.sg/

group/cjttd/)，Drugbank(https://go.drugbank.com/)，PharmGBK(https://www.pharmgkb.org/)数据库，以“gouty arthritis”为检索词，获取疾病相关靶点，并将5个数据库所得靶点取并集。

1.3 药物-疾病共同靶点确定及网络构建 使用R语言程序将所得的小香勾活性成分靶点与GA疾病靶点进行映射，取二者交集获得小香勾治疗GA的潜在作用靶点并绘制韦恩图。通过可视化分析软件Cytoscape 3.7.2进行“药物-靶点”网络构建，并利用cytoHubba插件进行网络拓扑参数分析及核心靶点筛选。

1.4 蛋白互作网络的构建与筛选 将映射所得药物与疾病的交集靶点上传至STRING数据库中进行蛋白质-蛋白质相互作用关系(protein-protein interaction, PPI)网络的绘制，并将所得数据导入Cytoscape 3.7.2软件中，进行拓扑分析及核心靶点筛选。

1.5 基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析 基于DAVID(https://david.ncifcrf.gov/，DAVID 6.8)数据库进行小香勾治疗GA的潜在作用靶点的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，限定物种为人，以筛选出关键靶点参与的主要分子生物过程或信号通路,根据所得结果使用R语言绘制条形图、气泡图等。

2 结 果

2.1 小香勾活性成分信息与作用靶点 通过检索PubChem数据库，获得小香勾6个相关活性成分的二维及三维结构图，具体信息见表1。对活性化合物进行药效团模型靶点预测，按标准化得分(normalized fit score)>0.4筛选靶点，共获得药物靶点535个。

表1 小香勾相关活性成分具体信息

2.2 药物-疾病共同靶点确定及网络构建 检索GeneCards、OMI、TTD、Drugbank、PharmGBK共 5个数据库，最终得到GA相关疾病靶点414个。利用R语言程序绘制药物-疾病交集靶点的韦恩图(图1)，可见小香勾治疗GA的潜在作用靶点有50个。

采用Cytoscape 3.7.2软件进行潜在作用靶点的可视化网络分析。网络由56个节点、204条边组成，其中菱形节点代表小香勾活性成分，椭圆形节点代表靶点(图2)。度值(degree)表示一个节点与网络中其他节点的连接次数，度值越高代表该节点的中心性越高。通过cytoHubba插件筛选出度值排名前10位的核心作用靶点：MAPK1、SRC、MMP9、PTGS2、MAPK14、MMP3、NOS2、ADAM17、PPARG、PLAU。

图1 小香勾治疗痛风性关节炎靶点韦恩图Fig.1 Venn diagram of target proteins for the treatmentof gouty arthritis by Xiaoxianggou

图2 小香勾活性成分-疾病靶点网络

2.3 蛋白互作网络(protein interaction network，PIN)的构建 将50个小香勾治疗GA的潜在作用靶点上传至STRING数据库中，绘制得到蛋白互作网络图，其中ANK1和SAMHD1与其他靶点间不存在相互作用(图3)。将得到的互作数据文件导入Cytoscape 3.7.2软件，依据度值大小筛选出排名前10位的核心作用靶点进行进一步的网络拓扑分析，结果如图4所示，其中节点颜色越深(红色)则代表该节点在网络中的度中心性越高。核心靶点具体蛋白信息见表2。

图3 靶点蛋白相互作用网络Fig.3 Targets protein interaction network

表2 核心靶点蛋白具体信息

MAPK1：丝裂原活化蛋白激酶-1；SRC：原癌基因酪氨酸受体激酶；MMPq：基质金属蛋白酶-q；PTGS2：前列素内环氧化物合成酶-2；MAPK14：丝裂原活化蛋白激酶-14；NOS2：一氧化氮合酶-2；ADAM17：解整合素金属蛋白酶-17；PPARG:过氧化物酶体增生激活受体γ；PLAU：尿激酶型纤溶酶原激活剂。图4 蛋白互作网络中的核心靶点Fig.4 Core targets in protein interaction network

2.4 GO功能富集分析与KEGG通路富集分析 对50个潜在作用靶点的GO功能富集分析结果见图5。共得到181个GO条目数，其中细胞组成(cellular component，CC)20条(11.0%)，分子功能(molecular function，MF)43条(23.8%)，生物过程(biological process，BP)118条(65.2%)。限定P<0.05，分别取前10项条目进行柱形图绘制，可见在CC层面上，小香勾对细胞质、溶酶体、细胞外泌体影响较大；在MF层面上，小香勾对血红素结合、药物结合、丝氨酸型-内肽酶活力影响较大；在BP层面上，小香勾对氧化还原反应、药物反应、胶原蛋白分解代谢的过程影响较大。

图5 基因本体功能富集分析柱形图Fig.5 Column diagram of gone ontology functional enrichment analysis

KEGG通路富集分析共得到29条相关信号通路，取排名前10位的通路绘制柱形图和气泡图(图6)。研究结果表明，小香勾治疗GA的作用主要与能量代谢途径、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢、蛋白聚糖途径、肿瘤坏死因子信号通路及血管内皮长生因子信号通路相关。

KEGG：基因组百科全书。A:柱形图；B：气泡图。

3 讨 论

黄嘌呤氧化酶活性异常增高是痛风性相关疾病的重要诱发因素之一[7]，LYU等[8]根据小香勾不同提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制率情况，进行药效物质筛选，确定了正丁醇有效部位，并基于HPLC-MS/NMR技术对小香勾活性成分进行分离鉴定，研究结果提示，小香勾有效部位主要为多酚类物质，其中丰度较高的活性化合物为：佛手柑内酯、毛地黄黄酮、补骨脂素、芦丁、羟基香豆素及绿原酸[9]。多酚类化合物因含有大量羟基，使其具有抗氧化、抗炎和镇痛等多种广谱药理活性，目前已成为天然产物研发热点之一[10]。本研究通过Pharmmapper数据库对小香勾6个多酚类活性化合物进行药效团模型靶点预测，在和疾病相关靶点取交集后共获得小香勾治疗GA的50个潜在作用靶点。依据拓扑参数分析结果筛选出的前10位核心靶点中，如MAPK1、MAPK14、PTGS2、NOS2、MMP9等均与炎症反应、氧化应激过程密切相关。

研究证实，小香勾醇提液具有较强的DPPH自由基及羟基自由基清除活性，这种清除能力与提取液中的多酚类物质含量相关，尤其是黄酮类和香豆素类化合物的水平，可显著影响其抗氧化活性[6]。另有文献表明，小香勾中的多种酚类活性成分均具有不同程度的抗炎作用，如芦丁通过经典炎症信号通路NF-κB、MAPK等抑制下游炎症因子的生成[11]，绿原酸可抑制JNK/AP-1通路活化，降低白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的基因表达[12]。因此，多酚类化合物可能是小香勾发挥抗炎镇痛作用的关键药效物质基础。

对小香勾治疗GA的潜在作用靶点进行KEGG通路富集分析结果显示，在代谢途径的基因富集程度最为显著，提示小香勾可能通过影响代谢途径发挥作用。GO功能富集分析结果也涉及代谢过程中多个关键环节，如氧化还原反应、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸结合反应等。近年来，越来越多的证据表明，细胞内代谢途径的改变与细胞炎性反应的发生、发展密切相关[13]。RENAUDIN等[14]的研究发现，MSU可以通过诱导NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3)活化促进巨噬细胞对葡萄糖的快速吸收，从而驱动糖酵解和炎症反应发生，而加入抗代谢药物可抑制炎症因子TNF-α和IL-1β分泌水平。不少研究表明，阻断糖酵解途径可显著降低MSU诱导的炎症反应，如XUE等[15]利用葫芦素B处理多种刺激活化后的骨髓巨噬细胞及小鼠GA模型，发现糖酵解关键酶下调，IL-1β生成减少；WU等[16]基于MSU诱导的腹膜炎模型同样发现通过毛壳素预处理可使小鼠腹腔巨噬细胞中糖酵解关键酶缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)和NLRP3相关基因mRNA水平显著降低。虽然目前尚缺乏充分证据表明小香勾对细胞代谢途径存在直接作用，但不少研究提示，一些多酚类天然产物可通过影响细胞代谢方式下调炎症反应，如绿原酸可抑制糖酵解及脂肪酸代谢调控M1型巨噬细胞极化，进而减少极化相关炎性因子IL-6、TNF-α、PTGS2、CXCL-10的表达水平[17]。另有文献表明，白藜芦醇可通过调控M2-型丙酮酸激酶(pyruvate kinase muscle isoenzyme 2，PKM2)干预肿瘤细胞糖酵解途径，导致细胞增殖减少[18]。

在生物过程层面上，小香勾对氧化还原影响较大。研究显示，除了炎症过程之外，另一个与痛风有关的早期事件是氧化应激，大量物质如吞噬溶酶体、细胞因子和活性氧(reactive oxygen species，ROS)等在MSU晶体被吞噬的过程中释放，触发关节腔内的氧化状态，并进一步导致组织损伤[19-20]。DAI等[21]的研究结果显示，小香勾可抑制急性酒精性肝炎小鼠肝脏细胞中ROS相关氧化应激，同时促进超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)生成，从而降低肝脏细胞的凋亡水平和炎症反应。另有研究表明，小香勾根水提液可显著降低大鼠血清中丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，提高血清中SOD活性[22]，提示小香勾具有一定抗氧化的能力。不少研究也显示，氧化应激可调控细胞代谢途径，从而介导炎症反应发生[23-24]，这也与KEGG分析结果相一致。此外，花生四烯酸代谢也是KEGG富集分析结果中较为显著的通路之一，花生四烯酸的代谢产物如前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)和白三烯B4(leukotriene B4，LTB4)等被认为是痛风发作的重要介质，该通路也是传统抗炎镇痛药——NSAIDs发挥作用的关键靶通路[25]。LYU等[6]的研究发现，小香勾醇提液可抑制GA大鼠血清中TNF-α、PGE2的表达水平，显著减轻大鼠关节肿胀程度，提示小香勾可能通过作用于花生四烯酸通路发挥抗炎镇痛作用。

中药系统药理学数据库与分析平台的建立促进了中药大数据挖掘研究的快速发展，但目前常用的中药数据库如TCMSP、TCMID等主要收录传统中药品种，对于部分民族特有习用药材的收录缺失，无法满足民族药物研究需要。因此，本研究选用靶标垂钓平台Pharmmapper进行小香勾化合物靶蛋白筛选。该平台基于配体特征，通过评估目标化合物的药效团与数据库内部药效团模型的匹配程度来执行预测，测试结果表明，该方法可以成功预测88%化合物的靶点信息[26]。近年来，此类基于化学信息学预测小分子潜在靶点的方法已被广泛应用于网络药理学研究中，为药物新靶标的发现提供了可靠的信息技术支撑。

本研究结果表明，小香勾可能通过作用于多个靶点发挥抗炎镇痛的功效，且不同靶点之间往往还存在互作关系，体现了中药多成分、多靶点、多通路的特点。笔者将对潜在作用靶点通路进行科学验证，完善小香勾治疗GA的药理和毒理机制，以促进民族药物小香勾的现代化开发应用。