不同生长阶段甜灵芝产量及品质的比较研究*

李一凡，周振辉，陈东梅，黎 钢，张 智

（广东粤微食用菌技术有限公司，广东 广州 510663）

灵芝（Ganoderma spp.）来源于多孔菌科（Polyporaceae）灵芝属（Ganoderma），具有养心安神、止咳平喘的功效[1]。现代药理学研究表明灵芝具有抗炎、抗肿瘤、降血压、降血糖、免疫调节等药理活性[2-4]。随着灵芝显著的药效作用为大众熟知，人们对灵芝的应用从治疗病症转向预防和保健；使用切片的子实体煮水或煲汤，破壁孢子粉直接售卖或提取孢子油；相较而言，灵芝子实体更易获得，且售价远低于孢子粉加工产品。在民间使用最多的灵芝为赤芝（G.lucidum），但赤芝苦味重，大众接受度差，这对灵芝子实体的推广利用产生了一定影响。甜灵芝为1989年从日本引入的新品种[5]，其苦味较淡，味偏甜，口感优于赤芝，大众接受度较佳，食用评价高于赤芝，具有很高的市场开发价值。据文献报道，甜灵芝早期被认为属于赤芝的变种[5]，但具体的品种鉴定结果以及该品种的拉丁名，至今未有报道。随着分子生物学技术的发展，越来越多的研究者通过结合形态学与分子技术进行品种分类鉴定，以确定种属及来源。近年来，随着各方面研究的深入，大众在生物学及生理学特性[6]、菌种制作[7]、培养方式[8-9]、功能成分分析[10]、木质素降解酶活性[11]等方面对甜灵芝有了更多的了解。其栽培、生产目前已初具规模，掌握不同生长阶段的产量及品质可以更好地确定最佳采收时期及子实体开发方向，从而最大程度地提高菇农及企业的效益。通过分析、比较不同生长阶段甜灵芝子实体的产量、多糖及三萜含量、孢子粉产量、收粉后子实体的品质等数据，以为甜灵芝的规模化栽培提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

所用甜灵芝菌株为广东粤微食用菌技术有限公司保藏管（编号GL-AS）。由广东省科学院微生物研究所食用菌研究中心进行分子鉴定，采用试剂盒法提取其DNA，以ITS序列为引物进行扩增，再结合其宏观及微观形态，结果表明该甜灵芝菌株为无柄灵芝（G.resinaceum）。

1.1.2 仪器与试剂

磁珠法真菌DNA提取试剂盒B，广州迈宝生物科技有限公司；SHHL-1.2液压翻斗培养料混合机、SZDY-1000食用菌培养料冲压装袋机，漳州市兴宝机械有限公司；YXQ.WF22-800SZ卧式矩形压力蒸汽灭菌器，湖南共创医疗设备有限公司；HK-C2D双人垂直双面洁净工作台，广东环凯微生物科技有限公司；葡萄糖、蛋白胨，广东环凯微生物科技有限公司；麸皮，五得利集团商丘面粉有限公司；高粱，本地超市采购；木屑，产自佛山南海；棉籽壳，产自广州市白云区、新疆；碳酸钙，产自广州市白云区；17 cm×35 cm×0.005 cm聚丙烯折角袋，漳州天珍塑料制品有限公司。

1.1.3 培养基配方及制作

母种培养基：土豆200 g·L-1（去皮，切成小块后水煮，过滤，滤液备用）、葡萄糖20 g·L-1、琼脂20 g·L-1、蛋白胨 5 g·L-1、硫酸镁 1.5 g·L-1、磷酸二氢钾 3 g·L-1、VB11 mg·L-1，pH 自然。

原种培养料：高粱98%（浸泡过夜，煮至无白心），碳酸钙2%。

栽培种培养料及菌袋：木屑62%、棉籽壳27%、麸皮10%、碳酸钙1%，含水量63%～65%，pH 6.2～6.4，每袋装湿料1 kg。

1.2 试验方法

1.2.1 发菌培养

将接种好的试验菌袋放置在发菌房中黑暗培养，期间保证发菌房的环境参数为温度22℃～24℃、湿度60%～70%、CO2体积分数0.2%～0.3%。在发菌期间观测记录试验菇包的菌种萌发时间、长至袋肩时间、满袋时间、袋间温度以及其他生长情况。

1.2.2 出菇培养

待菌袋长满白色菌丝且海绵盖可见少量原基时在菌袋上开小口，之后立即移入出菇房中进行出菇生长情况观测，管理参数在黄毅[12]、陈锋平[13]的参数基础上稍作调整。期间保证出菇房的环境参数为温度26℃～27℃、湿度80%～90%、光照200 lx～600 lx；生长前期维持CO2体积分数0.1%～0.2%，待菌柄长至4 cm～5 cm时修枝，修枝后CO2体积分数降低至0.06%～0.08%，继续培养。在出芝管理过程中记录现蕾时间、菌柄长度变化、开伞情况。

1.2.3 采收

此菌株菌盖为椭圆形，在开伞过程中，根据菌盖大小设置3个生长阶段（S1：菌盖长直径为4 cm～6 cm；S2：菌盖长直径为6 cm～8cm；S3：菌盖长直径为8 cm～10 cm）采收子实体，测定并记录采收子实体的菌盖长直径及短直径、鲜重及干重、含水量、三萜及多糖的含量。

1.2.4 孢子粉产量

当子实体边缘的白色生长圈消失，菌盖表面出现少量孢子粉时将其放入特定的收粉装置中，进行孢子粉产量测定试验，收粉装置见图1。

如图1所示，收粉装置为规格40.5 cm×40.5 cm×28.0 cm的纸箱，内固定规格为80 cm×70 cm×0.005 cm的聚丙烯袋，箱口处固定1层无纺布，再外置1层塑料膜，每个收粉箱内放置4个菌袋。收粉完成时，用小刷子将子实体及菌袋表面的孢子粉轻轻扫入聚丙烯袋中，剪下子实体称重后，菌孔朝下放置在干净的A4纸上，隔日观察子实体是否继续喷粉以判断是否达到喷粉终点，收集的孢子粉称重后测定其含水量。观测并记录不同收粉时间（30 d、35 d、40 d、45 d、50 d、55 d）的孢子粉产量及子实体情况，确定最佳收粉时间。

图1 孢子收粉装置Fig.1 Collecting device of spore powder

1.3 多糖和三萜的含量测定

子实体60℃烘干，干品参照《中国药典》中灵芝多糖及三萜的测定方法进行含量测定[14]。

1.4 数据收集与分析

每个处理组观测60包，重复3次。采用SPSS 20软件进行数据统计分析，采单因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan法进行差异显著性测验。

2 结果与分析

2.1 发菌情况

供试灵芝菌株发菌情况见表1。

表1 无柄灵芝菌丝体生长情况Tab.1 Mycelium growth Growth of Ganoderma resinaceum

如表1所示，接种后约3 d菌种萌发，7 d～8 d菌丝长至袋肩，18 d～20 d满袋，后熟2 d～3 d出现原基顶盖现象，可以进行出菇处理。在发菌过程中两个菌袋间的温度变化为22℃～25℃，菌丝长至袋肩时袋间温度最高。

2.2 出菇情况

供试灵芝菌株出菇期生长情况见表2，开伞前及开伞后3个阶段的子实体形态见图2。

如表2、图2所示，出菇培养后3 d～4 d现蕾，14 d～16 d菌柄长度约为4 cm，此时进行修枝，再继续培养至开伞；22 d～23 d菌盖的长直径达4 cm～6 cm，26 d～27 d菌盖的长直径达6 cm～8 cm，29 d～30 d菌盖的长直径达8 cm～10 cm并出现轻微喷粉现象，子实体培养完成。该菌株出菇阶段表现出原基数量较多、菌柄细长、喷粉时间较早的生长特点。

表2 无柄灵芝出菇情况Tab.2 Fruiting of Ganoderma resinaceum

图2 不同生长阶段的无柄灵芝子实体Fig.2 Fruit bodies of Ganoderma resinaceum at different growth stages

按照试验设置的3个阶段采收子实体，并对各项指标进行统计分析，结果见表3。

表3 开伞后不同生长阶段的无柄灵芝子实体情况Tab.3 Fruit bodies of Ganoderma resinaceum at different growth stages after the pileus opening

由表3可知，在该培养条件下，菌盖长直径达到（9.37±0.46）cm，短直径达到（7.62±0.66）cm时甜灵芝子实体基本成熟，开始出现轻微喷粉现象。对于子实体的产量而言，随着子实体不断长大，其质量不断增加，但子实体含水量逐渐降低；子实体基本成熟时，平均单菇鲜质量为（30.86±1.70）g，含水量约77%。分析该甜灵芝子实体的三萜和多糖含量发现，随着培养时间的增加，子实体的三萜含量不断增加；在菌盖生长至最大，子实体成熟时三萜含量达到最高，为（2.46±0.64）%。与之相反，其子实体的多糖含量随着培养时间的增加不断降低，在开伞初期多糖含量最高，为（1.14±0.11）%。由此可见，要想获得三萜含量高的子实体，需要培养至成熟后再采收，而想要获得多糖含量高的子实体，则需要在开伞初期采收。

2.3 孢子粉产量

当边缘白色生长圈消失，出现轻微喷粉现象后将子实体放入收粉装置中，跟踪观测不同采收时间的孢子粉产量及子实体情况，结果见表4。

表4 不同收粉时间的无柄灵芝孢子粉产量及子实体情况Tab.4 Spore powder yield and fruit body of Ganoderma resinaceum at different times for harvesting spore powder

由表4可知，随着收粉时间的增加，孢子粉产量不断上升；到第40天时孢子粉干重为16.36 g/袋，产量变化幅度达到最大；到第50天时虽然孢子粉产量最高（16.53 g/袋），但从第40天之后产量的变化幅度开始减小，且持续降低。孢子粉的含水量在收粉初期最高。收粉后子实体的单菇鲜质量逐渐下降，与子实体的干燥程度呈正相关，收粉50天后子实体较轻且质脆，与烘干后的灵芝相似。观察发现收粉40 d时仅有极少数子实体可继续产生少量孢子粉，结合时间、成本以及收粉末期会出现孢子粉颗粒不饱满、品质差的情况，考虑孢子粉收集时间约40 d为宜，此时基本达到孢子粉采收的终点。

3 讨论与结论

甜灵芝为商品名，目前市售甜灵芝可能存在品种混杂的情况。通过鉴定发现供试的甜灵芝品种为无柄灵芝。柯斌榕[15]曾对中国部分灵芝产区种质资源进行调查，结果发现目前栽培的灵芝品种主要有3类，包括赤芝菌株13个、紫芝（G.sinense）菌株1个、无柄灵芝菌株4个。由此可见，无柄灵芝早已被广泛栽培和使用。尽管无柄灵芝与赤芝在形态上存在一定差异，但二者亲缘关系十分接近，经常容易混淆[16]。对无柄灵芝的有效成分测定结果表明，无柄灵芝子实体内三萜含量较赤芝高[17]。此外，彭惺蓉[18]从无柄灵芝中分离获得了18个化合物，主要为可能起到保肝作用的三萜类化合物。Ding等[19]对无柄灵芝三萜类化合物进行分析，发现其含有试验中作为标准品参照所用的8种灵芝酸。可见无柄灵芝内三萜类化合物丰富，作为子实体推广或保健品原材料进行开发利用，均具有很好的潜力。

供试甜灵芝子实体的三萜含量随着培养时长的增加而不断上升，但多糖含量随着培养时长的增加而降低，这与林应兴[20]、付立忠[21]等对赤芝的研究结果相一致，说明此甜灵芝菌株与赤芝有相似的生长规律。相较而言，甜灵芝在三萜含量上较其他灵芝菌株（霍芝1号、韩芝、日芝）更具优势[22]，因此更适合用于提取三萜类成分。

在收粉40天后此甜灵芝菌株基本已达到了喷粉终点，且子实体较干燥，考虑到成本问题，甜灵芝的收粉时间建议以40 d～50 d为宜。此外，该甜灵芝菌株的喷粉时间较早；且相较于已被报道的其他灵芝菌株（龙芝二号、沪农一号、南韩灵芝、美国大灵芝、中华红芝等）[23-24]，此菌株孢子粉产量较大，收粉时间适宜；因此该甜灵芝也可以作为一个收粉的品种进行开发利用。

在目前关于无柄灵芝的研究中，暂未发现有关其味道偏甜的报道，此甜灵芝菌株可能为无柄灵芝里较为特殊的一个品种。无柄灵芝与赤芝的亲缘关系十分接近，并具有相似的生长规律，且在三萜种类及含量上较赤芝有一定的优势。此外，此次供试菌株作为无柄灵芝中的一种，在孢子粉产量上也具有很好的表现，说明无柄灵芝也具有开发成产孢灵芝的潜能。虽然目前无柄灵芝已被广泛栽培，但因未被列入《中国药典》而导致其在加工利用中受到一定的限制，因此，推动该品种进入新食品原料名录对更充分地利用无柄灵芝的优势、丰富灵芝栽培产业及灵芝保健品行业都具有重要的意义。