Aβ寡聚体与阿尔茨海默病*

刘志安，林燕玲，韩爱东

厦门大学生命科学学院，福建 厦门 361100

阿尔茨海默病（AD，Alzheimer's disease）是一种神经退行性疾病，也被称为老年性痴呆（dementia），主要发生在60 岁以上的老年人。根据2019年世界老年痴呆症报告，目前全世界痴呆症患者数超过5 000万，预计到2050年，这一数字将达到1.52 亿［1］。因此老年痴呆症是这个世纪人类正面临的一个重大健康问题，但目前却没有有效的治疗方法和药物。

AD 患者早期表现出记忆缺失、思维能力下降、语言表达和身体移动能力受阻等特点，并伴有失眠、抑郁和消瘦等多种症状。其主要的病理特征是AD患者的大脑产生由β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积形成的淀粉样斑块（amyloid plaques）和由过度磷酸化的微管相关蛋白tau 聚集形成的神经原纤维缠结（NFT，neurofibrillary tangles）。AD 的两个主要生物标志物Aβ 和tau 之间存在密切的关系。一般认为Aβ 位于tau 的上游，Aβ 通过改变蛋白激酶和磷酸酶之间的平衡，进而影响tau 的磷酸化状态［2］，但人们对它们之间相互作用的认识还比较缺乏。此外，Aβ还能够促进tau在细胞之间的扩散和吸收［3］，从而加速AD 病理的进展。Aβ 的疏水特性使其容易发生自聚集，形成Aβ 寡聚体（AβO，Aβ oligomer）。Aβ寡聚体会破坏突触功能并导致神经元的死亡，最终影响AD 患者的记忆和认知功能。此外，Aβ 寡聚体的生成和神经元损伤的病理过程可能早在临床症状出现的几十年前就已经发生［4］。虽然针对Aβ 寡聚体的靶向治疗策略是一种非常有前景的方法，但目前尚无有效的靶向药物。因此深入研究Aβ 寡聚体的性质及其作用机制，特别是结构与毒性关系，对于AD 的诊断以及开发新型的治疗方法至关重要。

1 APP的结构与功能

人类淀粉样前体蛋白（APP，amyloid precursor protein）基因位于21号染色体长臂，包含18个外显子［5］。经转录后剪接可产生8种APP亚型，其中最常见的3 种亚型包括主要在神经元中表达的APP695 亚型（含有695 个氨基酸残基），以及较多在胶质细胞中表达的APP751和APP770亚型［6-7］。

APP 蛋白是一种Ⅰ型跨膜蛋白，主要含有胞外结构域（E1 和E2），跨膜结构域（TM，transmembrane domain），以及APP 胞内结构域（AICD，APP intracellular domain）（图1）。两个相邻的APP 能够形成同源或异源二聚体，还可以交联某些酸性多聚物，如肝素黏多糖硫酸酯［8-9］。E1可以进一步分为类生长因子和铜离子结合结构域，或者Kunitz类蛋白酶抑制子结构域。E1 结构域介导APP 形成二聚体，充当神经元黏附分子连接突触前后的神经元。E2 也叫作APP 中心结构域（CAPPD，central APP domain），它也能够介导APP 二聚体的形成。E2 含有一个典型的五肽序列RERMS，具有促进成纤维细胞和神经元生长的功能［10］。AICD大约由47 个氨基酸残基组成，其尾部存在保守的YENPTY 基序，是许多酪氨酸激酶以及衔接蛋白的结合位点，具有蛋白分选以及信号转导的功能［11-12］。

2 APP的水解与Aβ的产生

β-淀粉样蛋白（Aβ）是长度为39～43个氨基酸的肽段，是由APP 经过蛋白酶裂解而产生的［13］。Aβ序列包含3 个GXXXG 重复基序，其前端在APP 跨膜结构域的胞外近膜区，另外一半序列位于TM 结构域内（图1）。这个重复基序中保守的甘氨酸突变为亮氨酸会显著影响APP 的加工以及Aβ 的产生［14］。

APP 的蛋白酶裂解可以分为2 个途径，即淀粉样蛋白加工途径和非淀粉样蛋白加工途径（图1）。淀粉样蛋白加工途径一般发生于内体（endosome）和溶酶体（lysosome），因为内体和溶酶体的酸性环境对于β-分泌酶的活性非常重要［15］。首先，位于质膜上的APP通过内吞（endocytosis）进入网格蛋白包被的囊泡中，随后与内体融合［16］。接下来，内体膜上的β-分泌酶切割APP 产生两个片段：可溶性APP 片段β（sAPPβ，soluble peptide APP β）和长度为99 个氨基酸的C 末端片段（CTFβ，C-terminal fragment β）。最后，γ-分泌酶（γ-secretase）切割CTFβ 形成Aβ 单体和AICD［16］。Aβ 单体可以通过外泌体（exosome）释放到胞外［17］。γ-分泌酶能够切割出长度不同的Aβ 肽，例如Aβ（1～37）、（1～38）、（1～39）、（1～40）、（1～42）和（1～43）等［18］。Aβ（1～42）和Aβ（1～40）是大脑中两种主要的Aβ 类型，其中Aβ（1～42）是引起淀粉样斑块形成和AD 发病的关键Aβ类型［19］。

图1 APP结构域示意图和Aβ的形成过程Fig.1 Schematic diagram of APP structure and the formation process of Aβ

APP 还可以通过非淀粉样蛋白途径进行加工（图1）。首先，位于质膜的APP 被α-分泌酶（αsecretase）切割，经切割后释放出可溶性APP 片段α（sAPPα，soluble peptide APP α）和含83 个氨基酸的羧基末端片段（CTFα，C-terminal fragment α）。其中，所释放的sAPPα 是一种神经保护物质，能够减轻神经毒性物质的有害作用，保护神经元，并在神经元可塑性中起重要的作用［20］。而CTFα被γ-分泌酶进一步加工，生成2 个小片段：p3 和AICD。p3 释放到胞外，AICD 则滞留在胞内［21］。APP 到底是通过哪种途径进行加工很大程度上取决于APP与各种分泌酶的共定位情况［22］。

蛋白质的翻译后修饰会影响Aβ 的生成、种类和定位，最终影响到AD 的发展。Aβ 的糖基化发生在AD 早期，虽然糖基化会加速Aβ 的聚集与原纤维的形成速度，但是由于糖基化后形成的原纤维没有细胞毒性，因此Aβ 的糖基化反而是起着降低其毒性的作用［23-24］。此外，Aβ 的C 端Met35 还可以发生氧化，导致其可溶性增加并降低聚集倾向［25］。Aβ 还可以发生异天冬氨酸和焦谷氨酸化，这两种修饰在AD 病人的大脑中枢组织中明显升高，并在病人的血管壁和其内部的神经元细胞中发生沉积，从而加速了衰老的发生以及AD 的发展［26］。此外，最常见的磷酸化、乙酰化等蛋白质翻译后修饰，都在不同层次地影响着Aβ 和tau 蛋白。这些复杂的修饰涉及很多修饰酶和相关蛋白，其中一些关键蛋白是目前AD 治疗药物开发的热门靶点［27-28］。

3 从“淀粉样级联假说”到“Aβ寡聚体假说”

Aβ 单体容易发生聚集，产生各种类型的组装体，包括Aβ 寡聚体（AβO，Aβ oligomer）、Aβ 原纤维（Aβ protofibril）和淀粉样纤维（amyloid fibril）。AβO 是可溶性的，能够扩散到整个大脑。而淀粉样纤维的相对分子质量较大且不可溶，并聚集成淀粉样斑块（Aβ plaques），Aβ原纤维是淀粉样纤维的中间态［29］。在30年前，Hardy等［30］提出了具有深刻影响力的“淀粉样级联假说”。该假说指出由Aβ 沉积形成的淀粉样斑块会引起神经元死亡，并最终导致痴呆的发生。然而之后的许多研究，通过对AD 病人的大脑分析，发现了淀粉样斑块沉积和突触损失之间并没有直接的相关性［31-32］。此外，在AD 转基因小鼠大脑中检测出斑块沉积之前，这些小鼠就已经表现出了认知缺陷和记忆障碍［33-35］。直到1998年，Lambert等［36］证明Aβ能够自发形成小的可溶性寡聚体，称之为Aβ 衍生的扩散配体（ADDL，Aβ-derived diffusible ligands），而这种ADDL在没有淀粉样纤维或更大聚集体的情况下就具有神经毒性。随后越来越多的研究表明AβO 在AD 患者的脑提取物中有显著升高［37-39］，并且可以直接使用抗AβO 的敏感性抗体检测到［40］。同时AβO 特异性抗体可以有效地抑制它们的神经毒性［41］。不久，“淀粉样级联假说”逐渐被“Aβ 寡聚体假说”取代［42-43］，假说的内容修改为可溶性AβO 作为神经毒素，并非AD 患者后期形成的不溶性纤维或斑块，诱发突触损伤和记忆衰退。因此可溶性AβO 是神经毒素的发现极大地改变了人们对AD发病机制的理解。

4 AβO的分类

通过尺寸排阻色谱法（SEC，size-exclusion chromatography）［44］以及凝胶电泳等方法，人们以相对分子质量50 000 为界，可以将AβO 分为高相对分子质量（HMW，high molecular weight）和低相对分子质量（LMW，low molecular weight）两大类［45］。LMW 的AβO 包括二聚体、三聚体等，而HMW 的AβO 包括一种广泛报道的可溶性十二聚体Aβ*56［46］和环状前原纤维（APF，annular protofibrils）等［47］。除了根据相对分子质量分类之外，Glabe等［48］利用构象依赖性抗体也可以将这些AβO 分为两大类，即纤维途径AβO（on-pathway AβO）和非纤维途径AβO（off-pathway AβO）。纤维途径AβO 是能够形成Aβ 原纤维的寡聚体，而非纤维途径AβO则是不能形成原纤维的寡聚体，因此可以看出Glabe的分类基础是AβO 的组装途径及其与淀粉样斑块的关系。

哪些可溶性AβO 才是真正的神经毒素？纤维途径AβO和非纤维途径AβO是否均具有神经毒性，其毒性大小是否相同？而AβO 的毒性又与其结构密切相关，因此AβO 结构与毒性关系的研究也成为了当研究的热门［49-51］。然而AβO 结构分析受到其自身亚稳态和异质性的阻碍［44］。因此不确定这些AβO是否与AD致病相关，还是在实验条件下诱发的产物［51］。缺乏对毒性Aβ寡聚体的共同、一致的实验描述，使得不同研究小组之间无法对数据进行解释和直接比较［51］。可以肯定的是，不同种类的可溶性AβO 似乎具有类似的结构，并且可以穿过细胞膜的磷脂双分子层，这也是可能的致病机制之一［41，48，52］。

4.1 Aβ二聚体

Aβ 二聚体是目前研究得最多的AβO。Aβ 二聚体的水平在AD 患者和AD 小鼠模型的脑内显著地升高，并随着年龄的增长以及淀粉样斑块负荷的增加而增加［53-57］。此外，从AD 病人脑提取物中分离出的Aβ 二聚体能够损伤神经细胞的长时程增强效应（LTP，long-term potentiation）［53］。将提取的Aβ 二聚体注入啮齿类动物大脑后会导致其认知的缺陷［46，58-59］。Abdel-Hafiz 等［60］构建了一种只表达Aβ二聚体的早期AD小鼠模型TgDimer，并发现这种小鼠在第7个月时就表现了行为学的异常，神经递质转化效率降低等各种AD 早期的特征。Müller-Schiffmann 等［61］通过分子间二硫键设计了一系列稳定的Aβ 二聚体，其中Aβ（1～42）S8C 单体生成了均一的二聚体，且具有神经毒性，而Aβ（1～42）M35C 单体不仅能形成二聚体，也能跟野生型一样聚集成四聚体和更高的寡聚体。类似地，O'Malley等［62］设计了双酪氨酸交联Aβ（DiY Aβ），但可能由于DiY Aβ 缺乏明确的结构，因此对神经细胞的LTP 没有显著的影响。这些结果说明了Aβ 二聚体结构与毒性关系的重要性。Aβ 二聚体的毒性可能与其构象密切相关，某些构象的二聚体可能具有神经毒性，而某些构象的二聚体可能与原纤维以及淀粉样斑块的形成有关。

4.2 Aβ三聚体与Aβ*56

Aβ 也可以发生其他形式的聚集。过表达APP的转基因小鼠Tg2576 脑细胞外出现大量由Aβ*56形成的可溶性组装体，在第6～14 个月就会发生记忆衰退［63］。重要的是，在其他APP 转基因小鼠模型中也报告了Aβ*56 的存在，如J20［64-65］、Arc6/48［64］、3xTgAD［66］等，这些结果表明Aβ*56 是一种广泛存在的非纤维途径AβO。而且它存在于细胞外和膜提取物的两种可溶性蛋白质组分中，这表明该寡聚体应该是胞外形成的，并可能与神经元质膜上的表面受体相互作用［64，67-68］。由于在培养神经元的细胞提取物或条件培养基中未检测到Aβ*56［63］，因此它应该不是由原代神经元产生和分泌的。此外，在一项含有58名轻度认知障碍和AD患者的测验中发现，40 多岁受试者脑组织中Aβ*56丰度增加，但其水平与Aβ 二聚体或Aβ 单体无关，而与Aβ 三聚体呈正相关［49］。这表明Aβ 三聚体可能是构成非纤维途径AβO的结构单位。

Aβ*56 是Aβ 的十二聚体，在数月内保持相对稳定［63］。初级皮质神经元优先分泌Aβ单体和三聚体，而非二聚体。早在Tg2576 小鼠胚胎的第14 天时，脑组织中就存在Aβ 三聚体，并且贯穿整个生命周期［63］。在人脑组织中，Aβ 三聚体在1 岁时就开始出现了［49］。在小鼠和人脑中，Aβ 三聚体的丰度随着年龄的增长而稳定且缓慢地增加［63］。不仅如此，Aβ 三聚体早在淀粉样蛋白沉积数年甚至数十年之前就存在了［56］。这些证据都表明，Aβ 三聚体可能是非纤维途径AβO 的基本结构单位而与纤维途径关系不大。以Aβ 三聚体为基本结构单位，能够聚集形成更大的寡聚体，即六聚体、九聚体和十二聚体等非纤维途径AβO。使用针对Aβ 的N端和中心结构域的抗体（如6E10）或者使用抗非纤维寡聚体蛋白A11 抗体能够很明显地检测出Aβ 三聚体（13 000）、六聚体（27 000）、九聚体（40 000）和十二聚体（56 000）［41］。因此可以通过抗体反应性区分Aβ*56 和其他非纤维途径AβO（off-pathway AβO）［48］。

4.3 环状前原纤维

环形前原纤维（APF，annular protofibril）是一类具有环状或孔状结构的AβO。它们是Aβ 通过非纤维途径环化而形成［47，69］。APF 的相对分子质量超过90 000，类似于细菌的造孔毒素，能够通过插入到膜内形成膜通道进而改变神经元内环境平衡并诱导细胞死亡［52，70］。APF 的形成主要由Aβ 单体的浓度决定，并且很大程度上受到环境的影响［71］。同时这些结构很可能是AβO 形成的中间态，对AD的真正影响还需要更多的探索。

4.4 胞内AβO

AβO 导致细胞毒性的经典途径是Aβ 分泌到细胞外并形成寡聚体而产生细胞毒性，实际上Aβ 也能在神经细胞内积累而产生特定的毒性［72］。在转基因小鼠Tg2576 的细胞内，Aβ 积累可能引起线粒体呼吸链活性的降低［63］。目前认为胞内Aβ的积累主要是由受体介导的［73］。胞外形成的可溶性AβO可以通过神经元的α7AchR受体（α7 nicotinic acetylcholine receptor）介导而吸收，造成胞内积累而引起细胞毒性［74］。Fonar等［75］利用一种化学修饰的蛇毒素α神经毒素竞争性地结合α7AchR，阻碍了其与Aβ 的结合，进而减少胞内的Aβ 水平，明显改善了AD小鼠的记忆。

5 AβO介导的神经毒性

Butterfield 等［76］提出AβO 通过与细胞膜相互作用引起毒性效应。毒性机制可能包括形成膜通道，或者引起膜变薄或膜不稳定等。AβO 具有一定的去垢剂性质，能够去除脂质分子而使膜不稳定［77］。AD 患者神经元钙离子稳态失衡可能与AβO 孔道形成有关，例如上述的环状前原纤维等AβO被认为能够通过插入到膜内形成Ca2+敏感性通道而发挥作用［78］。此外，孔道形成使得神经元的Ca2+内流增加而导致钙稳态失调和线粒体功能障碍，进而诱导ROS 级联反应，最终导致神经元的凋亡和死亡等［79-80］。

同时AβO 还可以与神经元表面的受体结合，改变下游的信号通路，最终导致细胞的死亡。AβO 可识别20 多种受体，例如谷氨酸受体、细胞朊蛋白（PrPC）、β2-肾上腺素能受体（β2-AR）、p75 神经营养素受体（p75NTR）和α7-烟碱乙酰胆碱受体（α7nAChR）等［81］。α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体（AMPAR，α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor）是一种谷氨酸受体，含有4 个亚单位GluA1-A4，亚单位GluA1 和GluA2 在突触可塑性和LTP 的调节过程中起着重要的作用［82］。有研究表明，AβO 会导致AMPAR 亚单位GluA1 和GluA2 的内化［83］。Guntupalli 等［84］将海马神经元与AβO 孵育1～2 d 后，发现LTP 期间的突触后膜上的AMPAR 不再增加，进而对LTP造成损伤。

N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR，N-methyl-D-aspartate receptor）是另一种谷氨酸受体，也是一种离子通道，在调节突触形成和突触可塑性中起着关键的作用［85］。有研究表明，AβO 能够损害NMDAR活性，干扰NMDAR依赖的信号通路，导致突触丢失［86-87］。也有研究人员提出了不同的观点，即AβO 会导致NMDAR 活性异常增加［88］。AβO 过度激活NMDAR，导致Ca2+不成比例地流入神经元，从而造成兴奋性神经毒性［89］。此外，AβO还能诱导NMDAR介导的神经元氧化应激，而这种激活能够被一种减缓AD 的药物Memantine（美金刚，一种非竞争性的NMDAR拮抗剂）所抑制［90］。

细胞朊蛋白PrPC是一种重要的蛋白质。在正常的生理条件下，它能够抑制β-分泌酶的活性，减少APP 胞内结构域（AICD）的产生并调节Aβ 的代谢［91］。同时它也是一种具有高亲和性的Aβ结合蛋白［92］。Laurén 等［93］通过比较野生型和PrPC缺失小鼠之间PrPC和AβO 的相互关系，发现PrPC缺失小鼠中AβO 对LTP 没有产生显著的影响，因此PrPC与AβO 毒性可能存在相互促进的关系。Takahashi 等［94-95］的长期研究发现在老年AD 病人的AβO 斑块中可以检测到PrPC的积累。在感染致病性朊蛋白（PrPSC）的神经元和小鼠中发现α-分泌酶PDK-TACE 被下调，导致脑组织中Aβ（1～40）和（1～42）等片段的积累和沉积［96］。AβO 与PrPC结合后还能够激活酪氨酸激酶Fyn，导致NMDAR 的磷酸化，引起受体功能失调、兴奋毒性和树突棘回缩［97］。Fluharty 等［92］的研究表明PrPC的氨基端可以结合AβO 并且强烈抑制AβO 对培养的小鼠海马神经元的神经毒性，这也显示了其作为AβO 抑制剂的潜力。

6 治疗AD的药物开发

根据Aβ 寡聚体假说，可溶性AβO 作为神经毒素，触发突触受损和记忆丢失。而AβO 是由Aβ 单体聚集而成。因此如果能够减少Aβ 的表达水平或抑制Aβ 的聚集，就很有可能减缓AD 的进展。因此β-分泌酶和γ-分泌酶是2 个很有潜力的靶点。然而多种分泌酶抑制剂虽然坚持到临床后期，但是依然不能有效改善病人的认知能力［98］。γ-分泌酶的调节剂Tarenflurbil 能够有效地减少Aβ 肽的产生，但其副作用会干扰NOTCH 信号通路，增加患皮肤癌的风险［99］。

抑制Aβ 的聚集也是一种理想的策略。人们发现一类天然植物糖醇epi-inositol和scyllo-inositol 能够结合可溶性Aβ 单体，显著降低AD 动物模型大脑中不溶性Aβ（1～40）和（1～42）的水平以及斑块的形成［100］。但不幸的是，在轻度至中度AD 患者的临床Ⅱ期试验中，scyllo-inositol 虽然能够阻止AβO的形成，但未能显示出明显的疗效［101］。另一种氨基多糖类抗聚集剂tramiprosate［102］，能够结合Aβ（1～42）的K16、K28 和D23 残基并引起Aβ 的构象变化，从而抑制AβO 的形成［103］。临床上也表现出大脑损伤的减轻和短期记忆的改善等，而且对帕金森病（PD，Parkinson's disease）以及其他的神经性病变也有作用，但在对轻度至中度AD 患者的临床Ⅲ期试验中，该药物也没能展现出显著的效果［104］。因此tramiprosate的治疗效果还需要更多的试验才能得出明确的结论［105］。Jiang 等［106］根据Aβ 的结构设计了一个简单的α 螺旋多肽HASI，具有与AβO 结合的毫摩尔级亲和力，显示了其抑制AβO 细胞毒性的潜力。近几年来，多肽药物受到人们越来越多的重视，其本身的缺点已经得到了逐步的克服，大批的多肽药物正在临床试验中［107］，然而目前缺乏有效的化学小分子药物前体，因此HASI多肽的研发和利用令人期待。

目前共有5 个FDA 批准的小分子药物，包括3 个胆碱酯酶的抑制剂donepezil，galantamine 和rivastigmine，1 个NMDAR 抑制剂memantine［108］，但这些药物并非基于目前AD 的机制假说，并且只能起到延缓病症的作用。相比较而言，靶向Aβ 的单克隆抗体则是目前最具前景的策略。抗Aβ 的单克隆抗体具有优良的选择性，并且受体动物对它们的耐受性良好［109-110］。最近两款人源化的抗体包括Biogen 的Lecanemab 和Lilly 的Donanemab，被FDA 选为治疗突破性药物。与Lecanemab 类似的单克隆抗体Aducanumab，商品名为Aduhelm，也由Biogen 开发，不久前被FDA 批准为用于轻型至中度症状AD 病人使用的临床药物［111］。Aducanumab 抗体对AβO 具有选择性的高亲和力，每月一次的静脉注射能够使轻症病人的大脑Aβ 呈现剂量和时间依赖性减少，并能激活病人的免疫系统，以清除大脑中的AβO 以及淀粉样斑块［112］。在两项大型Ⅲ期临床试验中Aducanumab 的使用对早期和中期AD 病人有显著的改善［113］。虽然Aducanumab 单抗的上市间接支持AD 早期发病的“Aβ寡聚体假说”的相对正确性，但因为需要很大的剂量才能中和少量的AβO，因此其Ⅲ期临床效果还不能充分说明其有效性［114］。

7 总结与展望

从1907 年Alzheimer 医生首次报道了一个AD病例，到1992年提出的“淀粉样级联假说”，再到现在的“Aβ寡聚体假说”，从最初认为淀粉样斑块作为神经毒素，到现在认为可溶性AβO 作为最主要的神经毒素而导致突触损伤以及神经元死亡，我们逐渐对AD 的发病机制有了更为深刻的认识。在研究过程中，我们意识到可溶性AβO 的结构与毒性关系的重要性，同时这也是未来研究的重点之一。AβO 作为一个药物作用靶点，显示了巨大的潜力。Aducanumab 单抗的出现给了相关研究人员和AD 病人更多的信心，也证明了AβO 与AD 发病机制的紧密关系。然而目前Aducanumab 单抗的疗效还不理想，这可能跟抗体的吸收和特异性有关。此外，AD 病理非常复杂，包含了许多相互交叉的生物学过程，Aβ 还会触发其他病症的发生，如tau 病以及神经炎症等，因此AD 的改善可能需要通过联合治疗才能实现。总之，我们需要继续深入地研究AD 的系统发病机制，才能开发出更好的更有效的治疗方法和治疗药物［115-116］。