α-倒捻子素衍生物合成及其抑制磷酸二酯酶4活性研究*

邓金辉，黄悦，梁津豪，朱嘉琪，于思，刘昊柏，罗海彬，黄仪有，何细新

1. 广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006

2. 中山大学药学院，广东 广州 510006

磷酸二酯酶（PDEs，phosphodiesterase）是水解细胞内第二信使环腺苷酸（cAMP）或（和）环鸟苷酸（cGMP）的超级酶家族，共包括11 个酶家族（PDE1～11）［1］。由于cAMP 和cGMP 在生理活动中的重要作用，磷酸二酯酶已成为多种疾病，如心衰、银屑病、肺动脉高血压、认知障碍等的重要治疗靶点［2］。磷酸二酯酶4（PDE4s，phosphodiesterase 4）是PDE 家族的一种同工酶，有PDE4A、PDE4B、PDE4C 和PDE4D 四种亚型，可特异性水解cAMP［3］，广泛分布于炎性细胞、免疫细胞及中枢神经系统组织中，对细胞内cAMP 浓度及其下游信号传导具有重要的调控作用［4-6］。PDE4 型抑制剂药物已被广泛研究用于多种疾病治疗。Rolipram 作为第一代PDE4 抑制剂，被广泛研究用于哮喘等疾病治疗，但因对其他亚型选择性差，常伴有头晕、头痛、恶心和呕吐等副作用，因此常被用作PDE4抑制剂研究的阳性对照药物［7］。Roflumilast 是首个上市的PDE4 抑制剂（PDE4B IC50：0.84 nmol/L；PDE4D IC50：0.68 nmol/L），2010 年和2011 年先后被欧洲药物管理局（EMA）和FDA 批准用于严重慢性阻塞性肺病（COPD）治疗，以减少突然发作的次数或防止COPD 症状恶化［8］；Apremilast 是一种口服的选择性PDE4 抑制剂（IC50：74 nmol/L），2014 年被FDA 批准用于中至重度斑块型银屑病、银屑病关节炎的治疗［9-10］。2016年，FDA批准了首个外用PDE4抑制剂Crisaborole（IC50：490 nmol/L）用于特应性皮炎的治疗［11］。然而，PDE4 抑制剂通常伴有呕吐、恶心等不良作用，很大程度上阻碍了临床应用［12］。因此，寻找新型PDE4抑制剂具有重要意义。

α-倒捻子素，一种来自藤黄科藤黄属植物山竹Garcinia mangostanaL. 中的异戊烯基型氧杂蒽酮骨架类化合物，具有抗炎、神经保护等多种药理活性［13-16］。前期研究证实，α-倒捻子素是一种中等活性的PDE4D2 抑制剂（IC50=1 310 nmol/L），对其2-位异戊烯基氧化环合后所得中间体进一步修饰，发现在6-位酚羟基上引入烷基羧酸或烷基吡咯烷基团后可显著提高其抑制PDE4活性［17］。为进一步比较6-位含氮碱性侧链及其他基团对PDE4抑制活性的影响，本研究设计合成了11 个α-倒捻子素衍生物，并初步探讨其抑制PDE4构效关系。

1 合成路线

按照本课题组报道的合成方法［17］，α-倒捻子素物经DDQ 氧化环合得到α-倒捻子闭环衍生物1，然后在6-位酚羟基上经烷基化、还原、水解、酰化等方法合成目标化合物。目标化合物合成路线见图1～图4。

图1 中，化合物1 与不同链长的二溴烷烃反应得到中间体2a 和2b，接着与叠氮化钠反应得到化合物3a和3b，将3a和3b经三苯基膦还原得到目标化合物4a 和4b，4b 与1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐反应制得含胍基目标化合物5。

图1 化合物4a、4b和5的合成Fig.1 The synthesis of compounds 4a,4b and 5

图2中，化合物1与乙酰氯反应得到6，6与4-溴巴豆酸乙酯烷基化得到7，最后7 水解得到目标化合物8。

图2 化合物6和8的合成Fig.2 The synthesis of compounds 6 and 8

图3 中，化合物1 与相应的羧酸化合物在DCC和DMAP 反应条件下得到化合物9、10和11。化合物1与相应的溴代化合物发生烷基化反应得到化合物12和13。

图3 化合物9～13的合成Fig.3 The synthesis of compounds 9-13

图4 中，按照本课题组前期报道的合成方法［17］，化合物1 与7-溴庚酸乙酯经烷基化、水解反应得到化合物14，14 与单溴甲基川芎嗪反应得到目标化合物15。

图4 化合物15的合成Fig.4 The synthesis of compound 15

2 合成实验

1H NMR（400 MHz）和13C NMR（100 MHz）谱采用瑞士Bruker AV400 核磁共振仪测定（以TMS 为内标）；ESI-MS 采用安捷伦科技有限公司1260-6460三重四极杆液质联用仪；HR-MS（ESI）采用美国AB SCIEX TripleTOF®5600+质谱仪测定；柱色谱硅胶（200～300 目）为青岛海洋化工公司产品，高效硅胶GF254板（20 cm×20 cm）为德国默克公司；除溴甲基川芎嗪外其他化学反应试剂均通过商业途径购置，反应溶剂均为分析纯。

2.1 化合物1、2a、2b的合成

化合物1、2a、2b的合成参考文献［17］。

2.2 化合物3a、3b的合成

以3a 的合成为例。将2a（300 mg，0.57 mmol）加入至3 mL 干燥DMF 中，依次加入叠氮化钠（111 mg，1.70 mmol）和碘化钠（9 mg，0.06 mmol）。60 ℃下反应5 h 后， 加入10 mL 冰水，二氯甲烷（10 mL×3）萃取。合并二氯甲烷相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂。粗产物经硅胶柱层析纯化（乙酸乙酯-石油醚，体积比1∶19），得黄色固体3a（268.2 mg），收率为96%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ13.73（s，1H），6.74（s，1H），6.73（d，J= 10.0 Hz，1H），6.23（s，1H），5.57（d，J=10.0 Hz，1H），5.26～5.20（m，1H），4.17（t，J=6.0 Hz，2H），4.11（d，J= 6.6 Hz，2H），3.79（s，3H），3.59（t，J= 6.5 Hz，2H），2.16（p，J= 6.2 Hz，2H），1.85（s，3H），1.68（s，3H），1.47（s，6H）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ182.1，159.9，158.1， 157.2， 156.3， 155.4， 144.2， 137.5，132.0， 127.3， 123.2， 115.9， 112.2， 104.6，104.0，99.2，94.1，78.1，65.6，61.1，48.2，28.7，28.5，26.3，26.1，18.3。ESI-MSm/z514.1［M+Na］+。

同法，化合物2b 与叠氮化钠反应，得目标化合物3b：黄色固体，收率为90%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ13.76（s，1H），6.73（d，J= 10.1 Hz，1H），6.71（s，1H），6.22（s，1H），5.56（d，J= 10.0 Hz，1H），5.27～5.20（m，1H），4.11（d，J= 6.7 Hz，2H），4.08（t，J= 6.4 Hz，2H），3.79（s，3H），3.33（t，J= 6.6 Hz，2H），1.97～1.89（m，2H），1.85（s，3H），1.75～1.69（m，2H），1.68（s，3H），1.66～1.60（m，2H），1.46（s，6H）。13C NMR （100 MHz，CDCl3）δ182.2，159.8，158.1， 157.6， 156.3， 155.4， 144.2， 137.3，132.0， 127.2， 123.3， 115.9， 111.9， 104.6，104.0，99.0，94.1，78.0，68.6，61.0，51.4，28.7，28.7，28.4，26.3，26.1，23.5，18.3。ESIMSm/z520.3［M+H］+。

2.3 目标化合物4a、4b的合成

以4a 的合成为例。三苯基膦（174 mg， 0.66 mmol）缓慢加入至3a（251 mg，0.51 mmol）的四氢呋喃（3 mL）溶液中，60 ℃回流反应2 h后，加入1.5 mL 蒸馏水，继续反应7.5 h。反应完毕，减压蒸除四氢呋喃，加入20 mL蒸馏水，乙酸乙酯萃取（20 mL×2）。合并乙酸乙酯相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂。粗产物经硅胶柱纯化（甲醇-二氯甲烷，体积比1∶9），得到黄色固体4a（163.8 mg），收率为69%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ6.72（s，1H），6.71（d，J= 10.0 Hz，1H），6.21（s，1H），5.55（d，J= 10.0 Hz，1H），5.29～5.19（m，1H），4.16（t，J= 6.1 Hz，2H），4.10（d，J= 6.6 Hz，2H），3.78（s，3H），2.98（t，J= 6.8 Hz，2H），2.04（p，J= 6.4 Hz，2H），1.84（s，3H），1.67（s，3H），1.46（s，6H）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ182.1，159.8，158.1，157.6，156.3， 155.4， 144.2， 137.2， 131.9， 127.2，123.3，115.9，111.9，104.6，104.0，99.1，94.1，78.0，67.0，61.0，39.2，32.6，28.4，26.3，26.0，18.3。ESI-HRMSm/z：488.203 4［M+Na］+（488.204 4，calcd for C27H31NNaO6）。

同法，化合物3b 和三苯基膦反应，得目标化合物4b：黄色固体，收率为69%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ6.72（d，J= 10.2 Hz，1H），6.70（s，1H），6.21（s，1H），5.55（d，J= 10.0 Hz，1H），5.26 ～ 5.20（m，1H），4.10（d，J= 6.5 Hz，2H），4.07（t，J= 6.4 Hz，2H），3.78（s，3H），2.76（t，J= 6.4 Hz，2H），1.95～1.87（m，2H），1.84（s，3H），1.67（s，3H），1.60～1.57（m，2H），1.57～1.54（m，2H），1.46（s，6H）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ182.2，159.8，158.1，157.7，156.3， 155.4， 144.2， 137.2， 131.9， 127.2，123.3，115.9，111.8，104.6，104.0，99.0，94.1，78.0，68.8，61.0，41.9，32.8，28.9，28.4，26.3，26.1，23.5，18.3。ESI-HRMSm/z：494.252 7［M+H］+（494.253 7，calcd for C29H36NO6）。

2.4 目标化合物5的合成

向化合物4b（110 mg，0.22 mmol）的干燥DMF（1.2 mL）溶液中依次加入1H-吡啶-1-甲脒盐酸盐（96.7 mg，0.66 mmol）、N，N′-二异丙基乙胺（DIPEA，110 μL，0.66 mmol），室温反应15 h。反应完毕，向反应液中加入20 mL蒸馏水，少许碳酸氢钠调pH 至碱性，过滤。残留物经硅胶柱层析纯化（甲醇-二氯甲烷，体积比1∶9→氨水-甲醇，体积比1∶1），得到黄色固体5（55.0 mg），收率为47%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ6.54（d，J=10.0 Hz，1H），6.45（s，1H），6.06（s，1H），5.43（d，J=10.0 Hz，1H），5.25～5.14（m，1H），4.09～3.92（m，2H），3.88～3.73（m，2H），3.69（s，3H），3.19～2.94（m，2H），1.78（s，3H），1.75～1.67（m，2H），1.64（s，3H），1.62～1.53（m，2H），1.46～1.33（m，2H），1.39（s，6H）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ181.5，168.8，159.7，157.7，157.0， 156.1， 155.1， 143.6， 137.0， 131.6，127.0，123.4，115.7，111.8，104.6，103.8，98.9，94.0，78.0，68.7，60.9，41.2，29.8，28.9，28.4，26.2，26.0，23.6，18.3。ESI-MSm/z：536.275 8［M+H］+（536.275 5，calcd for C30H37N3O6）。

2.5 化合物6的合成

化合物1（700 mg，1.71 mmol）和三乙胺（1.36 mL，10.28 mmol）依次加入到20 mL 干燥二氯甲烷中，然后在冰浴条件下缓慢注入乙酰氯（0.73 mL， 10.28 mmol）。冰浴条件下反应5 h 后，常温反应10.5 h。减压旋干溶剂，粗产物经硅胶柱层析纯化（乙酸乙酯-石油醚，体积比1∶19），得到黄色固体6（538.5 mg），收率为70%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ13.49（s，1H），7.10（s，1H），6.72（d，J= 10.0 Hz，1H），6.25（s，1H），5.58（d，J=10.0 Hz，1H），5.27～5.18（m，1H），4.13（d，J=6.2 Hz，2H），3.77（s，3H），2.39（s，3H），1.83（s，3H），1.68（s，3H），1.47（s，6H）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ182.2，168.2，160.5，158.1，156.4， 153.9， 149.0， 146.7， 139.0， 132.3，127.4， 123.0， 117.0， 115.7， 110.7， 104.7，104.1，94.4，78.3，61.8，28.5，26.5，26.0，21.0，18.3。ESI-HRMSm/z：451.175 5［M+H］+（451.175 1，calcd for C26H27O7）。

2.6 化合物7的合成

化合物6（500 mg，1.22 mmol）加入至20 mL干燥丙酮中，然后依次加入碳酸钾（230 mg，1.66 mmol）和4-溴巴豆酸乙酯（0.18 mL，1.33 mmol），55 ℃加热回流反应12 h。减压蒸除溶剂后，水（10 mL）-乙酸乙酯（10 mL×3）萃取。合并乙酸乙酯相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂。粗产物经硅胶柱层析纯化（乙酸乙酯-石油醚，体积比1∶19），得到黄色固体7（56.3 mg），收率为10%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ13.70（s，1H），7.11（dt，J= 15.8，4.1 Hz，1H），6.73（d，J= 10.1 Hz，1H），6.71（s，1H），6.27 ～ 6.20（m，2H），5.57（d，J=10.0 Hz，1H），5.28～5.20（m，1H），4.84（dd，J= 4.0，1.9 Hz，2H），4.24（q，J= 7.1 Hz，2H），4.14（d，J= 6.5 Hz，2H），3.83（s，3H），1.85（s，3H），1.69（s，3H），1.47（s，6H），1.31（t，J= 7.1 Hz，3H）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ182.1，165.9，160.0，158.1，156.5， 156.4， 155.3， 144.3， 140.8， 138.0，132.2， 127.3， 123.1， 122.9， 115.9， 112.6，104.7，104.1，99.6，94.2，78.1，67.4，61.2，60.9，28.5，26.4，26.1，18.3，14.4. ESI-MSm/z：521.2［M+H］+。

2.7 目标化合物8的合成

将盐酸羟胺（13 mg， 0.19 mmol）和氢氧化钠（19 mg， 0.48 mmol）依次加入5 mL 干燥丙酮中。室温搅拌10 min 后，将化合物7（50 mg，0.10 mmol）加入反应中，与50 ℃中反应7 h。反应完毕，减压蒸除溶剂，加水10 mL，φ=5%稀硫酸溶液调pH 至1，乙酸乙酯（10 mL×3）萃取。合并乙酸乙酯相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂。粗产物经硅胶柱纯化（乙酸乙酯-石油醚，体积比1∶4），得到黄色固体8（20.1 mg），收率为41%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ13.62（s，1H），6.86（s，1H），6.73（d，J= 10.0 Hz，1H），6.62（dt，J= 5.9，1.5 Hz，1H），6.23（s，1H），5.57（d，J=10.0 Hz，1H），5.32～5.25（m，1H），5.24 ～ 5.19（m，1H），4.14（d，J= 6.5 Hz，2H），3.83（s，3H），3.40（dd，J= 7.1，1.4 Hz，2H），1.85（s，3H），1.69（s，3H），1.46（s，6H）。13C NMR （100 MHz，CDCl3）δ182.2，175.9，160.2， 158.1， 156.4， 154.9， 154.8， 144.4，141.4， 138.6， 132.3， 127.4， 123.0， 115.8，114.0，106.4，104.7，104.1，102.3，94.2，78.2，61.5，29.6，28.5，26.4，26.1，18.3。ESI-HRMSm/z：493.186 7［M+H］+（493.186 7，calcd for C28H29O8）。

2.8 目标化合物9～11的合成

以化合物9 的合成为例。将化合物1（100 mg，0.24 mmol）、衣康酸单甲酯（54 mg，0.38 mmol）和DMAP（6 mg，0.05 mmol）依次加入5 mL 干燥二氯甲烷溶液中，然后将环己基碳二亚胺（68 mg，0.33 mmol）的二氯甲烷（1 mL）溶液滴入，常温反应21.5 h。反应完毕，减压蒸除溶剂，水（10 mL）-二氯甲烷（10 mL×3）萃取。合并二氯甲烷相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂。粗产物经硅胶柱层析纯化（乙酸乙酯-石油醚，体积比1∶19），得到黄色固体9（65.4 mg），收率为51%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ13.49（s，1H），7.16（s，1H），6.72（d，J= 10.0 Hz，1H），6.64（s，1H），6.24（s，1H），6.00（s，1H），5.57（d，J=10.0 Hz，1H），5.23（d，J= 6.7 Hz，1H），4.14（d，J= 6.5 Hz，2H），3.75（s，3H），3.74（s，3H），3.49（s，2H），1.83（s，3H），1.68（s，3H），1.46（s，6H）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ182.2，170.8， 163.7， 160.5， 158.1， 156.4， 153.9，148.9， 146.8， 139.0， 133.0， 132.3， 131.2，127.4， 123.0， 117.0， 115.7， 110.7， 104.7，104.1，94.4，78.3，62.0，52.4，37.5，28.5，26.5，26.0，18.3。ESI-HRMSm/z：557.178 6［M+Na］+（557.178 2，calcd for C30H30NaO9）。

同法，化合物1 与硫辛酸反应，得目标化合物10：黄色固体，收率为23%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ13.48（s，1H），7.08（s，1H），6.71（d，J= 10.0 Hz，1H），6.23（s，1H），5.57（d，J=10.0 Hz，1H），5.21（d，J= 6.8 Hz，1H），4.12（d，J= 6.7 Hz，2H），3.74（s，3H），3.60（p，J=7.7 Hz，1H），3.25～3.15（m，1H），3.15～3.07（m，1H），2.66（t，J= 7.1 Hz，2H），2.54～2.42（m，1H），1.99～1.88（m，1H），1.82（s，3H），1.78～1.71（m，2H），1.68（s，3H），1.64～1.57（m，2H），1.46（s，6H）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ182.2，170.8，160.4，158.0，156.4，153.9， 149.0， 146.7， 138.9， 132.2， 127.4，123.0， 116.9， 115.6， 110.7， 104.7， 104.1，94.3，78.2，61.8，56.4，40.4，38.6，34.7，34.1，28.8，28.5，26.5，26.0，24.6，18.3。ESIHRMSm/z：597.197 0［M + H］+（597.197 5，calcd for C32H37O7S2）。

同法，化合物1 和2-吡嗪羧酸反应，得目标化合物11：黄色固体，收率为32%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ13.47（s，1H），9.50（d，J= 1.4 Hz，1H），8.89（d，J=2.4 Hz，1H），8.85（dd，J=2.3，1.5 Hz，1H），7.29（s，1H），6.74（d，J=10.1 Hz，1H），6.28（s，1H），5.59（d，J= 10.1 Hz，1H），5.29～5.21（m，1H），4.17（d，J= 6.3 Hz，2H），3.79（s，3H），1.83（s，3H），1.69（s，3H），1.47（s，6H）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ182.2， 161.6， 160.6， 158.1， 156.4， 154.0，148.8， 148.7， 147.1， 146.6， 144.9， 142.4，139.4， 132.6， 127.5， 122.8， 117.6， 115.7，110.6，104.8，104.2，94.4，78.4，62.2，28.5，26.6，26.0，18.4。ESI-HRMSm/z：515.182 6［M +H］+（515.181 3，calcd for C29H27N2O7）。

2.9 目标化合物12～13的合成

以化合物12 的合成为例。将化合物1（100 mg， 0.24 mmol）、 碳酸钾 （39.8 mg，0.29 mmol） 和2-溴甲基-3，5，6-三甲基吡嗪（51.6 mg，0.24 mmol）依次加入至5 mL干燥丙酮中，室温反应15 h。反应完毕，减压蒸除溶剂，水（10 mL）-乙酸乙酯（10 mL×3）萃取。合并乙酸乙酯相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂。粗产物经硅胶柱层析纯化（乙酸乙酯-石油醚，体积比1∶9），得到白色固体12（65.0 mg），收率为50%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ13.73（s，1H），7.00（s，1H），6.73（d，J= 10.0 Hz，1H），6.25（s，1H），5.57（d，J= 10.0 Hz，1H），5.28（s，2H），5.22（t，J= 6.5 Hz，1H），4.11（d，J=6.5 Hz，2H），3.75（s，3H），2.63（s，3H），2.54（s，3H），2.53（s，3H），1.83（s，3H），1.67（s，3H），1.47（s，6H）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ182.2， 159.9， 158.1， 157.2， 156.4， 155.3，151.9， 150.0， 149.1， 144.6， 144.4， 137.6，132.1， 127.2， 123.2， 115.9， 112.4， 104.6，104.0，100.0，94.2，78.1，70.7，61.2，28.5，26.3，26.1，21.9，21.5，20.7，18.3。ESI-HRMSm/z：543.248 7［M + H］+（543.249 0，calcd for C32H35N2O6）。

同法，化合物1与2-（二甲氨基）溴乙烷氢溴酸盐反应，得目标化合物13：黄色固体，收率为56%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ13.72（s，1H），6.71（d，J=10.0 Hz，1H），6.69（s，1H），6.20（s，1H），5.55（d，J= 10.0 Hz，1H），5.25～5.18（m，1H），4.17（t，J= 5.8 Hz，2H），4.09（d，J=6.5 Hz，2H），3.78（s，3H），2.84（t，J= 5.8 Hz，2H），2.36（s，6H），1.83（s，3H），1.67（s，3H），1.45（s，6H）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ182.1，159.8， 158.0， 157.3， 156.3， 155.3， 144.2，137.3， 131.9， 127.2， 123.3， 115.8， 112.0，104.5，103.9，99.1，94.1，78.0，67.3，61.0，57.8，46.0，28.4，26.3，26.0，18.3。ESI-HRMSm/z：502.220 7［M + Na］+（502.220 0，calcd for C28H33NNaO6）。

2.10 化合物14的合成

化合物14的合成参考文献［17］。

2.11 目标化合物15的合成

将14（100 mg，0.19 mmol）、2-溴甲基-3，5，6-三甲基吡嗪（40 mg，0.19 mmol）和碳酸钾（26.3 mg，0.19 mmol）依次加入至5mL 干燥丙酮中，常温反应6.5 h。反应完毕，减压蒸除溶剂，水（10 mL） -乙酸乙酯（10 mL×3） 萃取。合并乙酸乙酯相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂。粗产物经硅胶柱层析纯化（乙酸乙酯-石油醚，体积比3∶17），得到黄色油状物15 （29.6 mg）， 收率为23%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ13.77（s，1H），6.72（d，J=10.1 Hz，1H），6.70（s，1H），6.21（s，1H），5.56（d，J= 10.0 Hz，1H），5.26-5.20（m，1H），5.19（s，2H），4.10（d，J= 6.5 Hz，2H），4.05（t，J= 6.4 Hz，2H），3.78（s，3H），2.52（s，3H），2.50（s，3H），2.49（s，3H），2.40（t，J= 7.4 Hz，2H），1.92～1.86（m，2H），1.84（s，3H），1.74～1.68（m，2H），1.67（s，3H），1.57～1.49（m，2H），1.46（s，6H），1.45～1.39（m，2H）。13C NMR （100 MHz，CDCl3）δ182.2，173.4，159.8，158.1，157.7，156.3，155.4，151.4，149.1，149.0，144.9，144.2，137.2，131.9，127.2，123.3，115.9，111.8，104.6，104.0，99.0，94.1，78.0，68.8，65.1，61.0，34.1，29.8，28.9，28.9，28.4，26.3，26.1，25.9，24.9，21.8，21.6，20.6，18.3。ESI-MSm/z：671.4［M + H］+。

3 目标化合物抑制PDE4活性

离心机（Sigma，6K15），涡旋仪（Vortexgenie），BioPhotomer 分光光度计（德国Eppendorf 公司），Ni-NTA（Qiagen，Valencia，CA）亲和色谱柱，蛋白质自动纯化系统（GEAkta Purifier 100），液体闪烁计数器（PerkinElmerTricarb2910）。所用试剂均为分析纯。

靶标蛋白PDE4 的表达、纯化及活性测定参照本课题组已发表论文［17］。所有的化合物均用DMSO 溶解，化合物梯度稀释，加到最终的反应体系中，保证DMSO的浓度应当比1%更低。

先将表达质粒pET15b-PDE4D2（催化结构域，86～413）转化入大肠杆菌E.coli菌株BL21 携带重组质粒的CodonPlus 中。E.coli细胞在含100 μg/mL 氨苄青霉素、20 μg/mL 氯霉素和w=0.4%葡萄糖的LB 培养基中在37 ℃下生长至A600＝0.7，后加入0.1 mmol/L 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达，并在15 ℃培养20～40 h。重组的PDE4D2 催化结构域通过Ni-NTA 亲和柱纯化。经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测试可知PDE4D2（催化结构域）蛋白质的纯度达到95%以上。

［3H］-cAMP（20 000～30 000 cpm，GE Healthcare）溶液中加入缓冲液（50 mmol/L Tris pH8.0，10 mmol/L 氯化镁， 0.5 mmol/L 二硫苏糖醇），待测化合物溶液，混匀。然后加入已测定浓度的上述纯化的蛋白质溶液，在25 ℃下静置反应15 min。加入0.2 mol/L ZnSO4和0.2 mol/L Ba（OH）2终止反应，［3H］-AMP 沉淀析出，而上清液中保留未反应的［3H］-cAMP。取上清液，加入2.5 mL 闪烁液，振荡混合后用PerkinElmer 2910 液体闪烁计数器测定。每次测量至少重复3 次，至少8 个浓度。采用非线性回归方法计算IC50值。化合物对PDE4D2 的抑制活性见表1。

表1 目标化合物对PDE4D2的抑制活性Table 1 Inhibitory rates of the target compounds towards PDE4D2

结果表明，化合物4a、4b、5、6、8、11 和13 对PDE4 有较高的抑制活性（IC50＜1 000 nmol/L），且优于α-倒捻子素。其中化合物5 的抑制活性最高（IC50=247 nmol/L），为α-倒捻子素抑制活性的5倍。

在α-倒捻子素2，3 位形成吡喃环的基础上，与引入长链烷基吡咯烷相比较［17］，引入脂肪胺（4a、4b、13）、胍基（5）同样可提高PDE4 抑制活性。比较脂肪胺化合物（4a、4b、13）的PDE4 抑制活性可知，一定长度的烷基链对活性的保持是必需的，本研究所合成的脂肪胺化合物中以胺基和α-倒捻子素母核相隔5个碳原子时活性最好。与长链脂肪胺相比，胍基取代物5 可进一步提高对PDE4 的抑制活性。对比前期研究中的羧酸类化合物尤其是化合物14，胺基类化合物和胍基类化合物活性较弱。但因其烷基链长不一样，是否因取代基团不同所致尚需进一步研究。

图5 化合物5对PDE4D2的抑制曲线Fig.5 Inhibition curves of compound 5 towards PDE4D2

6 位羧酸酚酯类化合物（6、9、10、11）中，吡嗪羧酸酚酯化合物（11，IC50=421 nmol/L）的抑制活性是乙酸酯化合物（6）的两倍，而化合物9、10 则对PDE4无活性。与化合物11相比，当吡嗪羧酸酯部分替换为川芎嗪基团（12）时，对PDE4 无活性，这可能与甲基的位阻有关。

当6 位引入羧酸基团时，抑制PDE4 活性显著增强（化合物8），但末端羧基成酯后则活性显著下降（9、15），可能由于羧基可增强化合物与PDE4 蛋白催化域中金属离子相互作用所致。化合物8（IC50=281 nmol/L）与前期研究中具有相同链长饱和烷基羧酸（丁酸） 取代化合物（IC50=44 nmol/L）比较［17］，活性下降近7倍，说明双键不利于抑制PDE4 活性。与链长为7 个碳的化合物14（IC50=16 nmol/L）比较，化合物8 活性更低，说明更长的烷基链，有利于羧基与PDE4 催化域金属区的相互作用提高活性，这与文献［17］结论一致。

4 结 论

本文在本课题组前期研究的基础上，进一步对α-倒捻子素2，3-位闭环产物的6-位酚羟基进行修饰，设计合成了11个衍生物；体外PDE4抑制活性结果显示7 个化合物（4a、4b、5、6、8、11 和13）的活性强于α-倒捻子素（IC50＜1 000 nmol/L），其中6位长链烷基胍类化合物5 的PDE4 抑制活性最强（IC50=247 nmol/L），为α-倒捻子素活性的5 倍，且优于阳性对照药物Rolipram。