柴胡疏肝散对早期肝纤维化大鼠JAK2/STAT3信号通路的影响

杨武斌，唐金凤，米本中

(1．重庆市高新区人民医院临床药学办公室，重庆 400039；2．重庆市人口和计划生育科学技术研究院/国家卫生健康委出生缺陷与生殖健康重点实验室，重庆 400020；3．重庆市中药研究院实验动物研究所，重庆 400065)

肝纤维化是一种慢性肝损伤疾病，是指在病毒、酒精、药物等刺激因素下所致的肝细胞外基质(extra cellular matrix，ECM)过度沉积，是各种慢性肝病共同的病理学基础[1]。由于持续的慢性肝损伤，肝纤维化会进一步发展为肝硬化甚至肝癌。早期肝纤维化是一个动态的病变过程，在适当干预条件下是可以逆转的[2]。目前，如何逆转早期肝纤维化的病理过程已成为临床工作和实验研究的热点。酪氨酸激酶2(Janus kinase 2，JAK2)/信号转导及转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信号通路是一条重要的炎症反应相关通路，能参与细胞的增殖、分化、炎症及凋亡等病理生理过程[3]。研究已证实，JAK/STAT信号转导通路与肝纤维化的发生和进展有着极其密切的联系，抑制JAK/STAT 信号通路的转导和激活可延缓肝纤维化的进展[4-5]。根据肝纤维化的临床症状及体征表现，中医将其归属于“胁痛”、“积聚”等范畴。柴胡疏肝散(Chaihushugan powder，CSGS)载于明代医家张景岳之《景岳全书》，是疏肝理气法的代表方，具有疏肝理气、和血止痛之功效，主治肝气郁滞证[6]。本研究模拟肝纤维化的中医肝郁血瘀病机，应用CCl4建立大鼠早期肝纤维化模型，初步探讨CSGS 对模型大鼠肝功能指标、纤维化指标和肝脏病理学改变的影响，并检测CSGS 对肝组织中JAK2/STAT3 信号通路的调节作用，进一步探讨CSGS对早期肝纤维化防治作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级SD大鼠50只，体质量200~250 g，由重庆市中药研究院实验动物研究所提供，生产许可证号SCXK(渝)2017-0003。在重庆市中药研究院实验动物研究所常规条件喂养(12 h光/暗循环，室温22 ℃，湿度30%~40%)。

1.2 柴胡疏肝散水煎剂的制备

柴胡疏肝散(CSGS)包含的所有中药材均购自重庆市高新区人民医院门诊中药房。柴胡10 g，陈皮10 g，川芎10 g，醋香附10 g，枳壳6 g，白芍6 g，炙甘草2 g。称20倍处方量，将中药材充分浸泡30 min后，用10倍体积水煎1 h，取上清液，再用10倍体积水煎浓缩至含生药2 g/mL(约540 mL)。4 ℃分装保存备用。

1.3 主要试剂和仪器

FastKing cDNA 第一链合成试剂盒(天根生化科技有 限 公 司)； SYBR Green master mix(KAPA Biosystems)；TRIzol Reagent(美国Life Technologies 公司)；透明质酸(hyaluronic acid，HA)、Ⅲ型前胶原(procollagen type III，PCⅢ)、Ⅳ型胶原(collage typeⅣ，Ⅳ-C)ELISA 试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；β-actin 兔多克隆抗体(Abmart 公司)；JAK2兔多克隆抗体、STAT3 鼠单克隆抗体(美国Abcam 公司)；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG 抗体和羊抗鼠IgG抗体(CST公司)。

实时荧光定量PCR 仪(美国Bio-Rad 公司)；DM 4000B 显微镜(德国Leica 公司)；Vortex 混合仪(上海启前XH-D)；超净工作台(北京半导体设备一厂)；凝胶成像系统Tanon 1600(上海天能科技有限公司)。

1.4 方 法

1.4.1 动物分组及造模SD大鼠50只，适应性饲养1周后，按随机数字表法随机分为正常组，模型组，CSGS 低(3.5 g/kg)、中(6.3 g/kg)、高(12.6 g/kg)剂量治疗组，每组10 只。除正常组外，各组大鼠腹腔注射40% CCl4橄榄油溶液(1 mL/kg)，每周2次，连续10周诱导肝纤维化模型[7]；正常组以等容量橄榄油腹腔注射代替。CSGS给药组于造模同时灌胃给药，正常组和模型组给予等量蒸馏水，每天1 次。造模第5 周时，随机抽取正常组和模型组各2 只大鼠，雌雄各半，若大鼠出现精神萎靡、反应迟钝、毛色干燥粗糙，病理结果显示肝组织损伤、炎症细胞浸润、胶原纤维形成、肝组织正常结构被破坏，则判定早期肝纤维化模型成功建立。第10周结束实验，将全部大鼠隔夜禁食(禁食不禁水16 h)，次日腹主动脉采血，取肝组织，一部分用10%的甲醛固定后制备石蜡切片，另一部分于-80 ℃冰箱中保存。

1.4.2 大鼠血清中肝损伤指标检测腹主动脉采血后静置，以3 000 r/min 离心(离心半径16 cm)10 min，分离血清。全自动生化分析仪检测丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)的含量，评价肝功能。

1.4.3 大鼠血清中肝纤维化指标测定取“1.4.2”项下大鼠血清样品，严格按照ELISA 试剂盒说明书检测血清透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)，评价肝纤维化程度。

1.4.4 肝脏外观形态观察及肝系数测定取大鼠肝脏，用高倍相机在同背景同视野下拍外观形态。生理盐水洗血，滤纸吸干，称取肝质量，计算肝系数。

1.4.5 肝组织病理学检查取肝组织置于4%多聚甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡切片，HE 染色后置于倒置显微镜下观察肝组织的病理改变。

1.4.6 实时荧光定量PCR 检测肝组织中JAK2 和STAT3 mRNA的表达

按TRIzol 试剂盒说明书提取大鼠肝组织总RNA，测定RNA 的浓度及纯度。按照FastKing cDNA 试剂盒说明合成cDNA 第一条链。实时荧光定量PCR(real time quantitative，qPCR)扩增目的基因，β-actin 作为内参，结果采用2-ΔΔCT法进行相对定量分析，应用Beacon designer 7.90设计引物，由Invitrogen公司设计合成。目的基因引物序列见表1。

表1 qPCR引物序列、扩增产物大小

1.4.7 Western blot 法检测JAK2 和STAT3 蛋白的表达水平将保存于-80 ℃的各组肝组织各取100 mg，提取组织蛋白并测定浓度。每孔上样30 μL，采用12%的SDS-PAGE 进行分离后，转至PVDF 膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，经TBST洗涤后分别加JAK2一抗(稀释度为1∶1 000)，STAT3 一抗(稀释度为1∶5 000)，内参β-actin一抗(稀释度为1∶2 000)，在4 ℃下孵育过夜，TBST再次洗涤后，加入山羊抗兔或山羊抗鼠辣根酶标记二抗(稀释度均为1∶2 000)，室温孵育1 h，洗膜，ECL化学发光试剂对其曝光显影及拍照。

1.5 统计学处理

采用SPSS 20.0 软件进行统计分析，数据以xˉ±s表示，组间两两比较采用LSD-t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以α=0.05为检验水准。

2 结 果

2.1 CCl4诱导大鼠肝纤维化模型的评价

造模第5 周时，观察正常组和模型组大鼠的一般情况，并随机抽取正常组和模型组各2 只大鼠，肝组织病理切片HE 染色结果见图1。正常组大鼠皮毛光滑，反应敏捷，性情温和，食欲正常；HE 染色结果显示肝组织的肝细胞形态正常，结构完整。模型组大鼠皮毛蓬乱、无光泽，动作迟缓，易暴躁、恐慌；HE染色结果显示肝组织中可见肝细胞体积增大，细胞质内有圆形空泡，可见增生性胶原纤维，同时有大量炎性细胞浸润。以上结果提示造模成功。

图1 早期肝纤维化大鼠肝组织病理改变(HE染色)

2.2 柴胡疏肝散对早期肝纤维化大鼠血清中ALT 和AST活性的影响

大鼠血清中肝损伤指标检测结果见图2。与正常组相比，模型组大鼠血清中ALT和AST水平显著升高(P＜0.01)；与模型组相比，柴胡疏肝散低、中、高剂量组血清ALT、AST水平均降低(P＜0.05或P＜0.01)。

图2 柴胡疏肝散对早期肝纤维化大鼠血清ALT和AST含量的影响

2.3 柴胡疏肝散对大鼠血清中早期肝纤维化指标的影响

见表2。与正常组相比，模型组大鼠血清透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)含量显著升高(P＜0.01)；与模型组相比，柴胡疏肝散低、中、高剂量组的血清HA、PCⅢ、Ⅳ-C含量均显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。

表2 柴胡疏肝散(CSGS)对各组大鼠血清中纤维化指标的影响(ng/mL)

2.4 大鼠肝系数

图3显示，肝系数一定程度上反映肝脏肿胀程度。与正常组比较，模型组大鼠肝脏系数升高(P＜0.01)；与模型组比较，柴胡疏肝散低、中、高剂量组显著降低肝系数(P＜0.05)。

图3 柴胡疏肝散对早期肝纤维化大鼠肝系数的影响

2.5 柴胡疏肝散对早期肝纤维化模型大鼠肝组织病理学的影响

组织病理学检查结果见图4。正常组大鼠肝细胞结构完整，肝细胞索排列整齐，小叶轮廓清晰，肝细胞未见肿胀及其他异常；模型组大鼠肝细胞出现明显水肿，体积变大，细胞质内有圆形空泡，肝中央静脉充血扩张，肝细胞索呈不规则排列，有炎性细胞浸润；柴胡疏肝散低、中、高剂量组肝组织的炎性病变及坏死程度均较模型组明显减轻，其肝组织损伤程度处于正常组与模型组之间。

图4 HE染色观察各组大鼠肝组织病理改变

2.6 柴胡疏肝散对肝组织JAK2 和STAT3 mRNA 表达的影响

qPCR检测结果见图5，可见与正常组比较，模型组大鼠肝组织中JAK2 与STAT3 mRNA 表达显著升高(P＜0.01)；与模型组比较，柴胡疏肝散各剂量组不同程度均下调JAK2和STAT3 mRNA的表达(P＜0.05或P＜0.01)。

图5 柴胡疏肝散对大鼠肝组织JAK2、STAT3 mRNA表达的影响

2.7 肝组织中JAK2和STAT3的蛋白表达

Western blot 检测结果见图6。与正常组比较，模型组JAK2 和STAT3 蛋白表达显著升高(P＜0.01)；与模型组比较，柴胡疏肝散中、高剂量组明显降低JAK2、STAT3 蛋 白 表 达(P＜0.05 或P＜0.01)，低 剂 量 组 的STAT3蛋白表达显著降低(P＜0.05)。

图6 各组大鼠肝组织JAK2和STAT3蛋白表达情况

3 讨 论

肝脏是人体解毒器官，有害物质沉积于肝脏或免疫反应均可造成肝细胞损伤、肝组织变性，引起肝内结缔组织增生等一系列代偿反应而形成肝纤维化。肝纤维化的病理过程十分复杂，以细胞外基质过度沉积、肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)活化为病理特征。肝纤维化进展至后期即形成肝硬化甚至肝癌。因此早期治疗肝纤维化具有重要意义。

肝纤维化是由于细胞外基质蛋白的积累造成的。CCl4是一种选择性肝毒性物质，在肝脏中可引起毒性三氯甲基(CCl3)自由基，引起炎症反应，能激活肝星状细胞，产生肝细胞外基质(extra cellular matrix，ECM)，最终导致严重肝损伤[8]。去除致病因素是最佳治疗策略，但许多慢性肝病中，致病因素和相关因素往往难以消除，这表明开发抗肝纤维化药物的重要性。本实验结果表明，经CCl4诱导后，大鼠的肝结构被破坏，出现炎性细胞浸润，纤维组织不同程度增生，说明大鼠肝纤维化模型建立成功。经柴胡疏肝散干预后，大鼠肝细胞坏死和胶原纤维增生程度均减轻。本实验柴胡疏肝散降低肝系数，降低血清ALT、AST、HA、PCⅢ、Ⅳ-C 水平，提示柴胡疏肝散能降低肝脏损伤并抑制纤维化进程。

JAK2/STAT3通路是一条由众多细胞因子组成的信号通路，在人体肝脏中表达，并参与肝再生、免疫等过程。在促炎因子的作用下，能够诱导肝内炎性细胞聚集，刺激HSCs 增殖，合成胶原增加，ECM 大量沉积[9-10]。众所周知，HSCs 的持续性活化，合成过量的胶原蛋白为主的ECM并在肝内沉积，促进纤维结缔组织增生。本研究发现，CCL4诱导的肝早期纤维化大鼠经柴胡疏肝散干预10周后能够显著改善肝纤维化大鼠的肝功能，缓解肝脏病理学改变，并能显著降低肝组织中JAK2 和STAT3 的mRNA 以及蛋白的表达。表明柴胡疏肝散影响JAK2/STAT3 信号通路的转导，且具有缓解肝纤维化的作用，其可能的机制是通过抑制JAK2/STAT3 通路的激活等多环节、多靶点来发挥作用，但柴胡疏肝散是如何调节JAK2/STAT3 信号通路缓解早期肝纤维化，是否还有其他的作用机制，这些仍然不是十分明确，还需要更深入的研究加以证实。