蜡样芽孢杆菌、产色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌三重PCR检测方法建立与应用

胡 慧，李田美，姜艳芬

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

奶牛乳房炎是由理化因素刺激和多种病原微生物感染引起的一种乳腺疾病，严重威胁奶牛养殖业和乳制品行业发展，每年给全球造成的经济损失高达350亿美元[1]。据统计，我国奶牛临床乳房炎发病率为20%～75%，而在某些地区发病率甚至超过75%[2]，引起奶牛乳房炎的病原菌种类繁多，以葡萄球菌属、肠杆菌属、链球菌属和芽孢杆菌属为主，由于地域、气候等因素的不同，各个地区主要致病菌也有所差异[3-4]。

前期研究对陕西关中地区3个奶牛养殖场采集的126份临床乳房炎乳样进行细菌分离纯化、16S rDNA鉴定和生化鉴定，共分离纯化得到11个属的病原菌，其中蜡样芽孢杆菌、产色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌的分离率较高，分别为15.9%、11.9%和4.8%，且肺炎克雷伯氏菌均分离自经过头孢喹肟和头孢噻呋轮换用药治疗的乳房炎乳样。蜡样芽孢杆菌已成为引起欧洲食物中毒事件的第三大常见菌[5]，摄入被蜡样芽孢杆菌污染的食物会引起恶心、呕吐和腹泻，同时该菌也是引起奶牛乳房炎的重要环境致病菌，能依附于其他细菌加快黏附并定植于乳房上皮细胞中，导致乳腺的感染，严重者可致奶牛死亡。Fei P等[6]从奶牛场350个环境和生牛乳样本中共检测到56株蜡样芽孢杆菌，若管理和清洁不当，则是引起乳房炎的潜在威胁。产色葡萄球菌是牛、绵羊、山羊中常见的皮肤共生和机会性乳房炎病原体，同时也是奶牛乳房炎常见病原菌凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)中分离率最高的细菌，能产生多种肠毒素，引起乳房持续性的感染，导致乳体细胞计数增加和牛奶的品质下降，在欧洲和美国被认为是引起奶牛亚临床乳房炎的最常见非金黄色葡萄球菌之一[7-8]。肺炎克雷伯氏菌是重要的条件性致病菌，广泛存在于自然界中，可引起严重的肺炎、血液感染、临床乳房炎[9]。Gao J等[10]从中国13个省的123个奶牛场临床型乳房炎的奶样中共分离肺炎克雷伯氏菌124株(51%)。该菌对β-内酰胺类抗生素有耐药性[11]，并且能够迅速传播和转移，抗生素治疗效果不理想，从而导致乳腺的长期感染和产奶量大幅度降低[12]，且奶牛康复后也无法恢复正常生产水平，造成严重的经济损失。因此，致病菌的快速检测对于临床治疗与防控至关重要。

目前，国内外学者已针对乳房炎常见病原建立了单项[13]以及多重PCR检测方法[14-16]，但尚无同时检测这3种病原菌的多重PCR方法报道，本研究建立了蜡样芽孢杆菌、产色葡萄球菌及肺炎克雷伯氏菌的三重PCR方法，为畜牧生产及可能引起奶牛乳房炎的相应病原菌的检测提供高效、特异的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和引物 蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、产色葡萄球菌(Staphyococcuschromogenes)由西北农林科技大学兽医公共卫生实验室分离鉴定并保存；大肠埃希氏菌(ATCC 25922)、沙门氏菌(CVCC2185)、金黄色葡萄球菌(ACCC 01011)、链球菌(CVCC 1887)、产气荚膜梭菌(CVCC49)，腐败梭菌C55-1(CVCC60021)，购自中国兽医微生物菌种保藏中心，由西北农林科技大学兽医公共卫生实验室保存。

根据GenBank中收录的基因序列信息并参考相关文献[17-19]，引用蜡样芽孢杆菌的溶血素基因hblA、肺炎克雷伯氏菌的溶血酵素基因khe、产色葡萄球菌的超氧化物歧化酶sodA引物序列，并由北京擎科生物科技有限公司合成。引物的序列、扩增片段长度见表1。

表1 三重PCR引物序列

1.1.2 主要试剂 普通营养琼脂培养基、脑心浸出液肉汤培养基(BHI)，青岛科源生物科技公司产品；DNA标准DL 2 000，近岸蛋白质科技有限公司产品；细菌基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技有限公司产品。

1.1.3 主要仪器设备 生物显微镜，重庆中显光电仪器有限公司产品；PCR仪、冷冻高速离心机，Eppendorf AG公司产品；电泳仪，北京六一生物科技有限公司产品；生化培养箱，宁波江南仪器厂产品；NanoDrop OneC，Thermo Fisher Scientific公司产品。

1.2 方法

1.2.1 单项PCR检测方法的建立 蜡样芽孢杆菌、肺炎克雷伯氏菌和产色葡萄球菌分别接种到BHI液体培养基，37 ℃培养24 h，按照细菌基因组提取试剂盒推荐步骤提取细菌基因组DNA。分别以3种菌的细菌基因组DNA为模板，以ddH2O为阴性对照，进行单项PCR扩增。PCR反应体系：2×ESTaqMastermix 12.5 μL，上、下游引物各1.25 μL(10 μmol/L)，DNA模板1 μL，灭菌ddH2O 9 μL。反应程序：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR扩增完成后，将PCR产物进行15 g/L琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像，观察结果并保存。

1.2.2 三重PCR检测方法的建立

1.2.2.1 扩增条件的优化 以3种菌的混合DNA为模板，对PCR反应的引物浓度、退火温度等进行优化，以确定最佳反应体系和反应程序。反应体系为：2×ESTaqMastermix 12.5 μL，不同组合浓度的3对引物，模板DNA混合物1 μL，灭菌ddH2O将反应体积补至25 μL。反应程序：94 ℃ 10 min；然后94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。对退火温度(50、50.9、52.3、54.0、56.3、58.1、59.3、60 ℃)、各引物浓度组合(BC-hblA、KP-khe、SC-sodA引物浓度(μmol/L)分别为0.4、0.1、0.2；0.4、0.1、0.1；0.4、0.15、0.2；0.4、0.15、0.1；0.6、0.1、0.2；0.6、0.1、0.1；0.6、0.15、0.2；0.6、0.15、0.1)等反应条件进行优化，筛选出三重PCR扩增的最佳反应条件。

1.2.2.2 特异性试验 采用优化后的扩增条件及程序分别以蜡样芽孢杆菌、产色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、产气荚膜梭菌、腐败梭菌的DNA为模板，进行三重PCR扩增反应。

1.2.2.3 敏感性试验 将过夜培养的蜡样芽孢杆菌、产色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌菌液用平板法进行计数。然后直接取蜡样芽孢杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产色葡萄球菌菌液混合并进行10倍倍比稀释，以各梯度菌液作为模板，采用优化后的三重PCR扩增条件进行反应。此外，分别提取蜡样芽孢杆菌、产色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌DNA，并用NanoDrop OneC超微量紫外分光光度计测量3种细菌基因组DNA浓度，然后混合3种DNA并进行10倍倍比稀释，以各梯度DNA为模板，采用优化后的三重PCR扩增条件进行反应。

1.2.2.4 稳定性试验 应用建立的三重PCR方法，分别取蜡样芽孢杆菌、产色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌的DNA样品各2份，每隔1周进行1次试验，重复检测3次，验证三重PCR的稳定性。

1.2.3 样品采集及检测 2020年10月，在陕西关中地区某奶牛场采集临床型乳房炎乳样共14份，采样前先经消毒液喷淋乳房及腹部体表以清除污物，再用消毒毛巾(一牛一巾)擦拭乳房和乳头部位，弃去前3把乳，收集30 mL乳汁于灭菌试管中，置于冰盒中于6 h内带回实验室。同时应用三重PCR方法和传统的分离培养及16S rDNA测序进行乳样细菌的检测。取奶样1 mL接入9 mL的BHI液体培养基中，37 ℃、180 r/min培养6 h～8 h，提取细菌基因组DNA，以ddH2O为阴性对照，3种细菌混合DNA为阳性对照，应用三重PCR方法检测；同时将乳样颠倒混匀，均匀涂抹于血平板上(50 mL/L绵羊血)，37 ℃培养24 h。分别选择不同形态特征的菌落经革兰氏染色观察细菌的形态后，再划线接种到BHI琼脂培养24 h～48 h。挑取经镜检确认纯化的菌落接种到BHI液体培养基，37℃、180 r/min过夜培养后划线，选取单菌落模板进行16S rDNA PCR扩增，符合测序标准的扩增产物送至北京擎科生物公司测序。测序结果在NCBI网站进行Blast序列比对，确定细菌种属。

2 结果

2.1 单项PCR的建立

分别对3种DNA进行单项PCR扩增后，蜡样芽孢杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产色葡萄球菌分别在995、425、222 bp处扩增出与目的条带大小相符的特异性条带(图1)，ddH2O阴性对照无扩增条带。

M.DNA 标准DL 2 000;1.产色葡萄球菌；2.肺炎克雷伯氏菌；3.蜡样芽孢杆菌；4.ddH2O

2.2 三重PCR检测方法的建立

2.2.1 退火温度的优化 将3种DNA等比例混合作为模板，选择不同的退火温度(50 ℃～60 ℃)进行三重PCR扩增，结果表明，退火温度在52.3 ℃～54.0 ℃扩增效果较好，确定54.0 ℃为最佳退火温度(图2)。

M.DNA 标准DL 2 000;1～8.退火温度分别为50、50.9、52.3、54.0、56.3、58.1、59.3、60 ℃；9.ddH2O

2.2.2 引物浓度的优化 取不同浓度的引物组合进行三重PCR反应，结果表明BC-hblA、SC-sodA、KP-khe引物浓度分别为0.6、0.2、0.1 μmol/L时扩增效果最好(图3)。

M.DNA 标准DL 2 000;1～8.BC-hblA、KP-khe、SC-sodA引物浓度(μmol/L)的组合分别为0.4、0.1、0.2；0.4、0.1、0.1；0.4、0.15、0.2；0.4、0.15、0.1；0.6、0.1、0.2；0.6、0.1、0.1；0.6、0.15、0.2；0.6、0.15、0.1；9.ddH2O

2.2.3 特异性检测 采用优化好的扩增条件进行三重PCR的特异性检测，结果显示以产色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和肺炎克雷伯氏菌DNA为模板均可扩增出特异的目的片段，而以其他常见细菌DNA和ddH2O阴性对照均未扩增出相应的条带(图4)，表明建立的三重PCR方法的特异性较好。

M.DNA 标准DL 2 000;1～4.分别为混合DNA、蜡样芽孢杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产色葡萄球菌；5～10.分别为大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、产气荚膜梭菌、腐败梭菌；11.ddH2O

2.2.4 敏感性检测 以蜡样芽孢杆菌、产色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌菌液混合后10倍梯度稀释作为模板，采用优化好的扩增条件进行三重PCR反应，结果显示，该方法对蜡样芽孢杆菌、产色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌菌液最低检测限为9.9×103、1.1×103、1.0×104CFU/mL(图5)。

M.DNA标准DL 2 000;1～7.分别为混合菌液的100～106倍比稀释；8.ddH2O

将三者DNA分别等比例混合后进行10倍系列稀释后作为模板，采用优化好的扩增条件进行PCR反应，结果显示，该方法对蜡样芽孢杆菌、产色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌DNA最低检测限分别为35.8、6.3、40.2 pg/μL(图6)。

M.DNA 标准DL 2 000;1～6.分别为混合DNA的100～105倍比稀释；7.ddH2O

2.2.5 稳定性检测 应用建立的三重PCR方法在不同时间对每份样品重复检测3次，结果显示3次的检测结果是一致的，表明该方法具有良好的可重复性。

2.3 样品采集及检测

应用建立的三重PCR方法和传统细菌分离培养方法同时对14份临床乳房炎乳样进行检测。结果显示，传统的细菌分离培养方法检测蜡样芽孢杆菌、产色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌的样品阳性率分别为28.6%(4/14)、14.3%(2/14)和7.1%(1/14)，三重PCR方法蜡样芽孢杆菌、产色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌的阳性率分别为35.7%(5/14)、14.3%(2/14)和7.1%(1/14)(图7)，其中蜡样芽孢杆菌的PCR检测阳性率高于细菌分离鉴定阳性率，总体细菌分离鉴定与PCR检测方法的阳性符合率为87.5%。

M.DNA 标准DL 2 000;1.混合DNA；2～15.样品；16.ddH2O

3 讨论

食品安全问题受到人们的广泛关注，奶源的安全问题乃重中之重。大规模使用抗生素造成的抗生素残留以及细菌耐药性增高导致奶牛乳房炎治疗困难，使得快速检测出主要致病菌成为奶牛乳房炎科学防控的前提。本实验室前期调查结果表明，陕西部分地区奶牛乳房炎乳样中蜡样芽孢杆菌、产色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌均占有较大比例，且蜡样芽孢杆菌和肺炎克雷伯氏菌耐药情况较为严重。

近年来的研究建立了针对奶牛乳房炎的主要致病菌金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、无乳链球菌等的多重PCR方法。马保臣等[15]建立的四重PCR方法对牛奶中金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母菌单项检测限度分别为104、102、103、103CFU/mL，该方法未进行4种病原菌混合样品的敏感性测定。Ashraf A等[16]建立了包括产色葡萄球菌在内的9种乳房炎病原菌的多重PCR方法，该方法虽然特异性强，敏感性达到50 pg/μL，但操作难度高且不易推广。陈亚明[17]建立的单项PCR对无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌最低检测限为0.1 pg/μL，对大肠埃希氏菌的最低检测限0.01 pg/μL，虽然单项PCR灵敏度高，但其建立的多重PCR敏感性较单项PCR方法低。Shome B R等[19]建立的多重PCR对细菌组合的牛奶稀释液提取的DNA进行检测时表皮葡萄球菌、产色葡萄球菌、溶血链球菌的最低检测限为102CFU/mL，与本研究菌液灵敏度相似，但该方法仍需在菌液浓度范围内提取细菌基因组DNA进行检测。王宇[20]建立了金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、铜绿假单胞菌绿的三重PCR方法，其灵敏度分别为5.97×10-2、6.68×10-2、5×10-2ng/μL，与本研究的DNA的最低检测量分别为35.8、6.3、40.2 pg/μL的灵敏度相近。

本研究成功建立了能够同时检测蜡样芽孢杆菌、产色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌的三重PCR方法，特异性好，对菌液以及DNA均具有较高灵敏度，对3种细菌菌液的最低检测量分别为9.9×103、1.1×103、1.0×104CFU/mL；对临床样品的检测与传统细菌分离鉴定相比较，检出率高。在检测乳房炎病原菌时如果没有检测到大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌或链球菌等常见病原菌，尤其经过常规用药未见效果时，建议应用本研究建立的方法进行检测以明确病原并采取相应的治疗措施。与传统的分离鉴定方法相比，本研究建立的三重PCR方法可以直接应用菌液作为模板进行PCR扩增而不需要提取细菌组DNA，明显缩短了检测时间，为明确引起乳房炎的病原菌的检测补充了新的方法，并为畜牧生产中这3种细菌的快速检测提供了有效方法。