奶牛乳房炎4种常见病原菌多重PCR检测方法的建立及初步应用

刘冬霞，张淑霞，徐海玲，许信刚，张 琪

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

乳房炎(Mastitis)是奶牛疾病中对奶牛养殖业经济影响较大的一种疾病，可导致乳制品行业的大量生产损失[1]。乳房炎通常是宿主对乳房内感染的反映，由大量细菌感染引起[2]。目前引起牛乳房炎的病原主要为革兰氏阴性菌，如大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌，以及革兰氏阳性菌，如无乳链球菌和金黄色葡萄球菌，这些微生物中的大多数也作为人类的病原体出现[3-6]。准确且经济有效的乳房炎病原体检测对于奶牛乳房炎的诊断、监测和控制非常重要。乳汁微生物鉴定常被认为是乳房炎诊断的“金标准”，该方法尽管较为准确，但耗时较长、方法繁琐、敏感性较低，故而难以满足临床需要。此外，许多病原体具有共同的形态特征，并在患病牛中引起相似的临床症状，通过培养的方法进行快速诊断多发性和继发性感染存在困难的，而不依赖于病原菌培养的多重PCR技术因其快速、特异性地同时检测多个细菌物种的特点已成为奶牛乳房炎病原菌检测的主流手段[7-8]。本研究通过比对分析，针对奶牛乳房炎临床常见致病菌如大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和肺炎克雷伯氏菌的相对保守基因设计特异性引物，建立和评估了多重PCR检测方法，为早期诊断和临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎克雷伯氏菌、蜡样芽孢杆菌、牛棒状杆菌、乳房链球菌、粪肠球菌和表皮葡萄球菌，均由西北农林科技大学动物医学院兽医微生物实验室保存。

1.1.2 培养基及试剂 2×EsTaqMasterMix、DNA标准、琼脂糖、细菌基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司产品；引物由奥科鼎盛生物科技有限公司合成；血清琼脂平板、营养琼脂平板和肉汤培养基，参照文献[9]方法配制。

1.1.3 仪器设备 PCR仪(K960)，力康生物医疗科技控股有限公司产品；电泳仪(DYCP-31DHDYY-6C)，北京六一生物科技有限公司产品；超净工作台(SJ-CJ-1FD)，苏洁医疗器械有限公司产品；立式压力蒸汽灭菌锅(LS-50HJ)，江阴滨江医疗设备有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank中已发布的大肠埃希氏菌phoA基因(序列号：M13345.1)、金黄色葡萄球菌nuc基因(序列号：CP029087.1)、无乳链球菌tuf基因(序列号：AF276256.1)、肺炎克雷伯氏菌khe基因(序列号：KX842080.1)，利用Primer 5.0分析软件，设计4对特异性引物，由奥科鼎盛生物科技有限公司合成(表1)。

表1 多重PCR引物

1.2.2 模板DNA的制备 细菌纯培养物按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作。

1.2.3 单项引物PCR扩增及鉴定 以上述方法提取的4个菌基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系(20 μL)为：Mix 10 μL，上、下游引物各1.0 μL，模板2 μL，ddH2O补足。按下列条件进行PCR扩增反应：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 40 s，94 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃终延伸10 min。取0.5 μL扩增产物经20 g/L的琼脂糖凝胶电泳进行检测分析。

1.2.4 多重PCR反应条件的优化 根据多次试验结果发现影响多重PCR反应结果的因素主要是退火温度和引物浓度，因此本试验对这两个反应条件进行了优化。将大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和肺炎克雷伯氏菌的基因组DNA等量混匀作为模板。将退火温度按照2 ℃梯度设定为51.8、54.1L、56.2L、58.5L、59.7L、62.0 ℃进行试验；按照0.25 μmol/L的浓度梯度设定各对引物浓度组合分别为(0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 μmol/L)进行优化，筛选多重PCR扩增的最佳反应体系和反应程序。

1.2.5 特异性试验 以上述方法提取的4个菌基因组DNA混合物作为模板，以非目标菌株基因组DNA和双蒸水作为对照，每孔均加入4对引物进行扩增，检测多重PCR反应的特异性。

1.2.6 敏感性试验 用核酸蛋白定量仪分别测得大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和肺炎克雷伯氏菌DNA模板的质量浓度分别为 171.1、191.6、109.6、208.9 ng/μL，将已测定浓度的4种菌的模板DNA按101～109梯度进行稀释，在优化好的多重PCR体系下进行扩增，观察单项PCR和多重PCR扩增的灵敏度。

1.2.7 临床奶样检测 陕西地区部分奶牛场送检了35份临床奶样，利用建立的多重PCR检测方法和传统细菌分离结合16S rRNA测序分析的方法同时对其进行检测，比较二者之间的检出率及符合率。符合率=(共同阳性数+共同阴性数)/所检样品数×100%。

2 结果

2.1 单项PCR扩增结果

单项PCR扩增结果如图1，可以分别观察到666 bp(大肠埃希氏菌)、287 bp(无乳链球菌)、477 bp(金黄色葡萄球菌)和209 bp(肺炎克雷伯氏菌)的条带，大小与预期相符。

M.DNA 标准DL 2 000;1.大肠埃希氏菌；2.无乳链球菌；3.金黄色葡萄球菌；4.肺炎克雷伯氏菌

2.2 多重PCR扩增条件的优化

对引物的浓度和退火温度进行了优化。多重PCR反应体系中各对引物终浓度各为1.0 μmol/L时最佳(图2)；最适退火温度为56.2 ℃(图3)。

M.DNA 标准DL 2 000;1.0.25 μL；2.0.5 μL；3.0.75 μL；4.1.0 μL；5.1.25 μL；6.1.5 μL

M.DNA 标准DL 2 000;1.51.8 ℃；2.54.1 ℃；3.5 6.2 ℃；4.58.5 ℃；5.59.7 ℃；6.62 ℃

2.3 特异性试验结果

使用4个引物对的引物混合物通过多重PCR扩增目标菌株和非目标菌株的基因组DNA(图4)，结果多重PCR测定分别为大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和肺炎克雷伯氏菌的均能扩增出666、477、287、209 bp的目的条带，而非目标菌株未观察到条带。

M.DNA 标准DL 2 000;1.大肠埃希氏菌+金黄色葡萄球菌+无乳链球菌+肺炎克雷伯氏菌；2.大肠埃希氏菌；3.金黄色葡萄球菌；4.无乳链球菌；5.肺炎克雷伯氏菌；6.蜡样芽孢杆菌；7.牛棒状杆菌；8.乳房链球菌；9.粪肠球菌；10.表皮葡萄球菌；11.阴性对照

2.4 敏感性试验结果

将提取的细菌基因组DNA混合后倍比稀释，利用优化好的多重PCR扩增条件进行扩增，分别测出多重PCR对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和肺炎克雷伯氏菌DNA模板最低检出限分别为17.11、19.16、109.6、20.89 pg/μL(图5A)，单项PCR检测最低量分别为大肠埃希氏菌1.711 pg/μL、金黄色葡萄球菌0.191 pg/μL、无乳链球菌1.096 pg/μL、肺炎克雷伯氏菌2.089 pg/μL(图5B、图5C、图5D、图5E)。

M.DNA 标准DL 2 000;1～9.101～109倍比稀释DNA的PCR扩增结果；A.大肠埃希氏菌+金黄色葡萄球菌+无乳链球菌+肺炎克雷伯氏菌；B.大肠埃希氏菌；C.金黄色葡萄球菌；D.无乳链球菌；E.肺炎克雷伯氏菌

2.5 临床样本检测

对35份的送检样品同时进行多重PCR及细菌分离鉴定进行检测，结果见表2；部分样品多重PCR检测结果见图6。多重PCR检测技术的阳性检出率为51.4%，细菌分离鉴定检出的阳性率为45.7%，两种方法同时检测4种病原菌检出的符合率为94.3%。

表2 样品检测结果

M.DNA 标准DL 2 000;1～10样品

3 讨论

乳房炎因其高患病率和高发病率已成为危害全球奶牛健康最重要的疾病之一。多项研究证实了乳房炎对畜牧生产的经济性和危害性[10]。近年来，国内对于奶牛乳房炎防治手段的研究在逐渐进步，但是还没有一种有效手段能对奶牛乳房炎进行预防和治疗，奶牛乳房炎发病率依然保持很高的水平。研究表明，可引起奶牛乳房炎的细菌多达上百种，乳房炎致病菌检测或鉴定不及时往往会延误疾病的治疗。因此建立一种针对奶牛乳房炎主要致病菌的诊断方法就显得尤为迫切。目前，PCR已经被广泛应用于病原的检测，尤其是多重PCR技术的出现更是极大地满足了临床检测需要[11-12]。本研究建立的多重PCR检测方法选取的大肠埃希氏菌phoA基因，金黄色葡萄球菌nuc基因，无乳链球菌tuf基因，肺炎克雷伯氏菌khe基因都具有高度保守又广泛存在的特点。根据以上基因设计的4对特异性引物，扩增出来的片段均正确且特异性良好。敏感性试验结果显示，多重PCR方法的灵敏度比单项PCR方法的相比降低了101～102倍，这可能是引物间的相互影响引起的，但已经能满足临床检测的需要。该方法可用于细菌培养物或临床样本，均能准确地鉴定病原菌。所建立分子检测试验对临床收集的35份样本检测中得到了验证(表2)。应用这种方法可以继纯培养物或临床样本中简单提取基因组DNA后，在1个工作日内确定出奶牛乳房炎感染的致病菌。

综上，本试验建立的多重PCR方法可以快速、特异性地诊断由主要致病菌大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和肺炎克雷伯氏菌单独或混合感染引起的奶牛乳房炎，且灵敏度高，能满足临床检测的需要，为临床感染用药提供指导。同时应用该方法可以了解牛群的健康状态，为提高群体健康管理的质量和精确度提供参考。