不同外周血单个核细胞分离方法对流式细胞术分析结果的影响

牟大超，吴沙沙，周 轶

(四川大学华西医院人类疾病和免疫治疗研究室，四川 成都 610041)

外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)包括淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞等，PBMC被广泛应用于生物医学领域。在天然免疫方面，通过分离PBMC能分化诱导出不同类型的树突状细胞(dendritic cell，DC)，DC在抗原识别和递呈方面的研究较为广泛[1]。在体液免疫方面，通过流式细胞术可分选出B淋巴细胞，该细胞对于全人源抗体的开发和应用具有重要意义。在细胞免疫方面，分离PBMC用于研究T淋巴细胞亚群和细胞因子水平能反映疾病发展程度[2-3]。此外，在生物治疗领域，如嵌合抗原受体T细胞免疫疗法等也离不开较好的PBMC分离方法[4-5]。

PBMC的分离方法有较为经典的Ficoll密度离心法、Percoll离心法和羟乙基淀粉(hydroxyethyl starch，HES)沉降法等[6-9]，根据样本类型和PBMC的后续应用可选择不同的分离方法。本研究采用Ficoll离心法、HES沉降法和先HES沉降再Ficoll离心(HES+Ficoll)3种方法来分离相同样本的PBMC，以探讨不同分离方法对所得细胞后续流式细胞术分析结果的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料2019年5月，选择四川大学华西医院人类疾病和免疫治疗研究室6位体检健康的工作人员为受试对象，采集每位受试者外周血15 mL。受试者纳入标准：无自身免疫性疾病、肿瘤、病毒和细菌感染等。本研究通过四川大学华西医院生物医学伦理委员会审查[2019年审(332)号],每位受试者均签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器人外周血淋巴细胞分离液购自北京Solarbio公司，HES购自加拿大Stemcell公司，1640高糖培养基和青链霉素购自美国Gibco公司，胎牛血清购自阿根廷Natocor公司，CD3流式抗体、CD4流式抗体和CD8流式抗体购自美国BD公司；细胞计数仪和显微镜购自美国Olympus公司。

1.3 实验方法

1.3.1 PBMC分离将15 mL外周血平均分为3份，分别采用Ficoll离心法、HES沉降法和HES+Ficoll 法进行分离。Ficoll离心法：用等体积1640基础培养基稀释后，加入预先加了3 mL外周血淋巴细胞分离液的分离管中，平角离心机中800×g(离心机加速度和减速度调至最低)22 ℃离心15 min，取中间白膜层用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)洗涤2次，所得细胞沉淀即为PBMC。HES沉降法：60 g·L-1的HES水溶液以51稀释混匀后在37 ℃孵箱中静置30 min，取上层澄清液体，离心得细胞沉淀，再用PBS洗涤2次，所得细胞沉淀即为PBMC。HES+Ficoll法：先用HES法得到细胞沉淀，再用外周血淋巴细胞分离液对其进行密度梯度离心，所得沉淀即为PBMC。分别用显微镜和细胞计数仪对3种方法得到的PBMC细胞进行形态观察和计数。

1.3.2 PBMC冻存采用每1×106个细胞加入1 mL 冻存液的体系进行细胞冻存，冻存液为含体积分数10%二甲基亚砜的胎牛血清，加入冻存液的细胞放入细胞冻存管，再放入程序降温盒，-80 ℃冻存过夜后转出，于-80 ℃长期冻存。

1.3.3 流式细胞术检测淋巴细胞将3种分离方法得到的冻存前后PBMC(冻存后细胞于37 ℃水浴复苏)用荧光活化细胞分选系统(fluorescence actirated cell sorting,FACS)buffer洗1遍后进行FVS780染色，然后用含体积分数1%新生牛血清的PBS溶液洗涤细胞2遍，进行CD3、CD4和CD8抗体染色，抗体稀释度均为1100，室温避光孵育 30 min，洗涤后于200 μL PBS中重悬，然后进行流式细胞术检测。根据前向散射光(forward scatter,FSC)和侧向散射光(side scatter,SSC)确定淋巴细胞群，并计算PBMC中淋巴细胞所占比例、淋巴细胞中活细胞(FVS780荧光强度小于1×102为活细胞)所占比例(细胞存活率)和活细胞中CD4+T细胞数量与CD8+T细胞数量的比值(CD4+T/CD8+T)。

2 结果

2.1 3种分离方法得到的PBMC的形态和计数结果比较3种分离方法得到的PBMC形态均一致(图1)，相比于另外2种方法，用HES沉降法分离得到的PBMC除淋巴细胞外还有部分红细胞。

A:Ficoll离心法；B：HES沉降法；C：Ficoll+HES法。

细胞计数结果显示,Ficoll离心法、HES沉降法和Ficoll+HES法得到的PBMC数量分别为(2.50±0.27)×109、(5.75±1.64)×109、(8.98±0.81)×108L-1，HES沉降法所得PBMC数量显著多于Ficoll离心法和Ficoll+HES法，差异均有统计学意义(P<0.05);Ficoll离心法所得PBMC数量高于Ficoll+HES法，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 3种分离方法得到的PBMC冻存前后流式细胞术分析结果比较结果见表1。冻存前，Ficoll离心法、HES沉降法和Ficoll+HES法得到的PBMC中淋巴细胞存活率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。HES沉降法得到的PBMC中淋巴细胞比例显著低于Ficoll离心法和HES+Ficoll法，差异均有统计学意义(P<0.05)；Ficoll离心法和HES+Ficoll法所得到的PBMC中淋巴细胞比例比较差异无统计学意义(P>0.05)。Ficoll离心法、HES沉降法和Ficoll+HES法得到的存活细胞中CD4+T/CD8+T比值比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 3种分离方法得到的PBMC冻存前后流式细胞术分析结果比较

冻存6个月后，Ficoll离心法、HES沉降法和Ficoll+HES法得到的PBMC中淋巴细胞存活率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。HES沉降法得到的PBMC中淋巴细胞比例显著低于Ficoll离心法和HES+Ficoll法，差异均有统计学意义(P<0.05)；Ficoll离心法和HES+Ficoll法所得到的PBMC中淋巴细胞比例比较差异无统计学意义(P>0.05)。Ficoll离心法、HES沉降法和Ficoll+HES法得到的存活细胞中CD4+T/CD8+T比值比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

3种方法分离得到的PBMC冻存后淋巴细胞存活率均低于冻存前，PBMC中淋巴细胞比例高于冻存前，差异均有统计学意义(P<0.05)；存活细胞中CD4+T/CD8+T比值与冻存前比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

PBMC的分离已成为细胞生物学、免疫学，特别是流式细胞术分析和分选细胞的必备技术手段[10-11]。目前常用的分离方法有Ficoll分离法、Percoll密度梯度离心和HES沉降法等。Ficoll和Percoll分离法均为密度梯度原理[12]，将样本中不同大小细胞进行分离，相对来说Ficoll分离法成本更低，常见于实验室中对外周血样本的单个核细胞进行分离，但需要依赖高速离心条件，对仪器和技术人员依赖较大。HES沉降法主要利用其能与红细胞所带的负电荷相结合，使红细胞凹面相贴，从而加速红细胞的沉降，分离出上层白细胞[13]，对硬件和技术人员要求不高，可用于病房、诊所及事故发生地血样的及时处理，并用于流式细胞术检测。

临床来源的样本以外周血为主，当前流式细胞术是分析免疫细胞亚群最常用的手段，故本研究主要评价3种分离方法得到的PBMC对后续流式细胞术分析结果的影响，以验证更为简便的HES分离方法替代传统Ficoll离心法的可行性。同一样本以Ficill离心法分离PBMC时，细胞较为均一，极少有红细胞混杂；使用HES沉降法进行分离时，所得细胞数量最多，但显微镜检查结果显示细胞不纯，含有部分红细胞；先HES沉降再进行Ficoll离心虽然细胞也较纯，但收获细胞数量受到影响。在对3种方法获得的单个核细胞进行流式细胞术分析时发现，无论是新鲜分离的PBMC还是冻存后的PBMC，其中的淋巴细胞存活率比较差异均无统计学意义；虽然使用Ficoll离心法所得的PBMC中淋巴细胞比例最高，HES沉降法所得的PBMC中淋巴细胞比例最低，但从能反应机体免疫功能的指标CD4+T/CD8+T比值来看，3种分离方法所得结果比较差异无统计学意义，说明3种分离方法均能反映样本的真实情况。使用HES法所得的淋巴细胞比例不高可能与其样本中掺杂了红细胞，导致细胞总量大有关。与冻存前相比，PBMC冻存后淋巴细胞存活率略有下降，但3种分离方法的淋巴细胞存活率仍高于75%，在可接受范围内。冻存后淋巴细胞中CD4+T/CD8+T比值与冻存前比较差异无统计学意义，证实PBMC冻存的可行性。有研究显示，HES分离方法还能用于稀有样本或少量样本的分离，如脐带血、骨髓等，但影响HES分离效率的因素较多，如HES浓度、HES与样本体积比例、沉降距离等[7,14]，因此针对具体样本，仍需对该方法进一步优化，形成针对特定样本的标准化分离流程。

综上所述，从分离所得细胞数量和纯度以及免疫细胞亚群来看，HES沉降法分离得到的PBMC可用于后续FACS分析，在条件有限的实验室可替代传统Ficoll分离法用于 PBMC的分离。