管道瓦斯爆炸致大鼠烧冲复合伤的特点及建模条件

宋明明，田林强，董新文，姚三巧，孟伟正，任文杰，王桂芝

(1.平煤神马医疗集团总医院急诊科，河南 平顶山 467000；2.新乡医学院第三附属医院创伤与骨科研究所，河南 新乡 453003；3.新乡医学院公共卫生学院，河南 新乡 453003；4.郑州大学第五附属医院病理科，河南 郑州 450052)

煤矿瓦斯爆炸事故现场人员死亡率高[1-2]，幸存伤员多有烧冲复合伤。呼吸道阻塞、肺部损伤多发、早期临床表现隐匿、临床治疗矛盾重重为烧冲复合伤后期死亡主要原因[3]。目前，虽然国内学者在瓦斯爆炸伤的救治工作中取得了一定的进展，但由于煤矿瓦斯爆炸事故通常比较分散，只有很少的医院有机会收治瓦斯爆炸伤患者，且瓦斯爆炸对人体的伤害数据较难获取，仍存在着基础研究薄弱、烧冲复合伤救治方法欠科学、救治理念不统一等一系列亟待解决的难题[4-5]，故通过动物实验来研究瓦斯爆炸对机体的伤害及修复机制有非常重要的意义。本研究采用φ2000瓦斯爆炸系统对大鼠进行瓦斯爆炸实验，观察大鼠死亡及存活情况、损伤部位和伤情特点，以及支气管及肺组织中caspase-3、caspase-9表达水平，探讨瓦斯爆炸事故实验室研究的条件，以达到精准动物建模、从分子层面阐明瓦斯爆炸致支气管及肺损伤的发生机制，为煤矿瓦斯爆炸伤害院前急救护理及临床救治提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康清洁级Sprague Dawley大鼠116只，6～8月龄，体质量230～270 g，由陆军军医大学野战外科研究所动物中心提供，饲养于该中心无特定病原体级动物房。所有大鼠自由进食水。本研究经新乡医学院动物伦理委员会批准，动物处置方法符合动物伦理学标准。

1.2 瓦斯爆炸系统及装置应用中国煤炭科工集团重庆研究院研制的φ2000瓦斯爆炸系统，管道直径2 m，长29 m，整个管道预试验安装3个压力传感器，正式实验安装4个压力传感器，实验动物距离出口 3.5 m 处。数据采集应用成都泰斯特电子信息有限责任公司开发的CS2000动态测试分析系统。电源采用12 V稳压直流电源，所测波形为非矩形波，火焰到达该点时间以波形第1个跳变时间为准。温度传感器为中科院自动化研究所生产的CIT-2MK红外线性化温度传感器，测温范围 40～2 000 ℃，采用15 V直流稳压电源，测量精度为满量程的±1%，响应时间为67 ms，适于在0～60 ℃环境下使用。应用陕西秦明电子(集团)有限公司宝鸡传感器研究所生产的 CYG系列固态压阻压力传感器，在测试过程中通过自制前置放大器接入CS20000动态测试分析系统，传感器量程分别为2× 105Pa和1 × 105MPa，适于在-40～80 ℃范围内使用，输出信号范围0～5 V，非线性为±0.08%，过载能力200%。

1.3 方法

1.3.1 瓦斯浓度设定及动物分组和处理将116只大鼠适应性喂养1周后分为实验组(n=96)和对照组(n=20)。实验组大鼠均匀放置于自行设计的双层鼠笼内，用角钢焊接的方式将鼠笼固定在爆炸装置内。依据本课题组预实验结果及文献报道[5]。本实验设置瓦斯浓度为9.55%，瓦斯容量为1.62 m3。起爆室达到预定的瓦斯浓度及容量后，通过点火系统进行点火，使瓦斯在管道爆炸并传播，点火的同时触发爆炸综合测试系统对传播方向上各测点的爆炸压力及火焰信息进行采集。对照组大鼠不进行瓦斯爆炸，其他实验条件同实验组。

1.3.2 实验组大鼠一般情况观察爆炸结束后，通过排风系统对实验管道进行排风，20 min后搜集实验动物。对实验组大鼠进行生命体征、灼伤程度观察记录，判断其意识、神态、呼吸情况、移动能力等。动物无生命体征判断为死亡，包括实验现场死亡及实验结束2 h以内死亡的动物。

1.3.3 实验组大鼠烧冲复合伤发生情况爆炸结束后，依据实验管道瓦斯爆炸烧冲复合伤标准评估烧冲复合伤发生情况。管道瓦斯爆炸烧冲复合伤标准：高温火焰、冲击波、有害气体中毒等综合因素造成的实验大鼠损伤结果，即肉眼可见的体表烧伤合并肺损伤及其他任何部位一处及多处损伤[6]。

1.3.4 2组大鼠支气管和肺组织取材实验组存活大鼠于爆炸实验结束24 h，用体积分数1%戊巴比妥钠(40 mg·kg-1)麻醉后处死，开胸，取右主支气管分叉处至肺门靠近分叉处一段及右侧肺组织前中叶，一部分用于大体形态观察，一部分固定于体积分数4%甲醛溶液中，常规石蜡包埋。按上述方法处死并解剖对照组大鼠，取支气管和肺组织，常规石蜡包埋。

1.3.5 2组大鼠早期支气管及肺损伤观察和肺损伤程度评估观察2组大鼠支气管及肺表面颜色及出血情况。光镜下观察2组大鼠支气管黏膜上皮有无脱落、管壁充血、水肿情况、中性粒细胞浸润情况；肺泡壁毛细血管及肺泡间质出血及水肿情况。判断肺损伤程度：重度肺损伤为肺脏大片状出血，出血总面积占全肺面积的50%以上；中度肺损伤为肺脏损伤及破裂面积在50%～10%；轻度肺损伤为肺脏呈散在的点状出血，出血总面积小于全肺面积的l0%[7]。

1.3.6 光学显微镜观察2组大鼠肺和支气管组织病理形态取2组大鼠石蜡包埋支气管及肺组织连续 4 μm 厚切片，常规苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色；切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、蒸馏水冲洗后室温下干燥，再经苏木精染液及冰乙酸酒精浸染后流水冲洗，碳酸锂饱和水溶液浸染，体积分数5%伊红浸染，最后梯度乙醇脱水，中性树脂封片，光学显微镜下观察组织病理学变化。

1.3.7 免疫组织化学染色法检测2组大鼠支气管及肺组织中caspase-3及caspase-9的表达取2组大鼠支气管及肺组织石蜡包埋标本连续4 μm厚切片，采用高压法进行抗原修复，应用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin-perosidase，SP)法检测支气管及肺组织中caspase-3及caspase-9的表达，兔抗大鼠caspase-3及caspase-9多克隆抗体以及SP试剂盒和二氨基联苯胺显色试剂盒购自武汉塞维尔生物科技有限公司，严格按照说明书进行操作。应用武汉塞维尔生物科技有限公司提供的阳性切片做阳性对照，以磷酸盐缓冲液代替一抗作空白对照。每只大鼠观察4张切片，上皮细胞胞质中见清晰棕黄色、黄褐色颗粒者为阳性细胞，结果按染色强度评分[8]。染色强度评分：0分为无着色，1分为淡黄色弱着色，2分为棕黄色中等强度着色，3分为棕褐色强着色。由2名病理医师采用双盲法阅片，光镜下随机观察并记录5个高倍视野中细胞的染色强度。无着色以-表示，弱着色、中等强度着色、强着色分别以+、++、+++表示，+、++、+++为表达阳性，计算阳性表达率，阳性表达率=阳性表达大鼠只数/总大鼠只数×100%。

1.4 统计学处理应用SPSS 24.0软件对数据进行统计学处理，计数资料以例数和百分率表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 瓦斯爆炸致大鼠大体损伤情况实验组大鼠体表烧伤发生率为100.0%。69.7%大鼠体表烧伤为体毛烧伤、部分区域结痂；累及皮肤烧伤7例，为Ⅱ度烧伤，分布于头及肢体末端、腹部、躯干等部位。30.3%大鼠体表烧伤为体毛轻度烧伤。存活大鼠均表现为精神差、趴卧不起、拒食、呼吸加速。

2.2 瓦斯爆炸致大鼠烧冲复合伤发生率、肺损伤发生率及死亡率烧冲复合伤及肺损伤发生率均为100.0%；大鼠共现场死亡19例，死亡率为19.8%，实验结束即时死亡17例，2 h内死亡2例。

2.3 2组大鼠支气管及肺大体和病理形态比较结果见图1和图2。对照组大鼠支气管及肺组织结构正常，无充血水肿情况，表面未见出血点；光镜观察，肺组织肺泡结构完整，肺泡腔存在、腔内有正常肺泡上皮细胞，肺泡隔内可见结缔组织细胞及毛细血管，支气管黏膜及黏膜肌内组织完整、无充血水肿。实验组大鼠支气管及肺组织颜色加深，支气管黏膜可见散在出血灶，肺组织表面呈点状及片状出血灶；光镜见肺泡间隔明显增宽，血管充血、灶状出血，肺泡腔内见淡粉色水肿液。支气管黏膜上皮细胞部分脱落，管壁充血、水肿，中性粒细胞及淋巴细胞浸润，黏膜肌内亦见大量中性粒细胞及淋巴细胞浸润，支气管黏膜腺体腺腔内分泌物增多。

A：对照组；B：实验组。

A：对照组；B：实验组

2.4 2组大鼠支气管及肺组织中caspase-3、caspase-9表达比较结果见表1和图3、图4。2组大鼠肺组织以及支气管组织中均有caspase-3及caspase-9表达。对照组大鼠支气管组织中caspase-3、caspase-9阳性表达率分别为25.0%、10.0%，肺组织中caspase-3、caspase-9阳性表达率分别为30.0%、15.0%；实验组大鼠支气管及肺组织中caspase-3、caspase-9阳性表达率均为100.0%。实验组大鼠支气管组织中caspase-3、caspase-9阳性表达率显著高于对照组，差异有统计学意义(χ2=68.310、62.986、P<0.05)；实验组大鼠肺组织中caspase-3、caspase-9阳性表达率显著高于对照组，差异有统计学意义(χ2=85.087、79.354,P<0.05)。

表1 2大鼠气管及肺组织中caspase-3及caspase-9的表达比较

A：实验组caspase-3表达；B：对照组：caspase-3表达；C：实验组caspase-9表达；D：对照组caspase-9表达。

A：实验组caspase-3表达；B：对照组caspase-3表达；C：实验组caspase-9表达；D：对照组caspase-9表达。

3 讨论

瓦斯爆炸伤最常见的伤害类型为烧冲复合伤[6]。烧冲复合伤是指在半封闭巷道环境中瓦斯爆炸产生的热力和冲击波导致的体表烧伤、冲击伤、爆炸伤、吸入性损伤等多脏器、多部位损伤的一种内外伤共存的创伤类型。烧冲复合伤具有伤情复杂、外伤掩盖内伤、诊断复杂以及治疗相互矛盾等特点。由于瓦斯爆炸致支气管及肺损伤的原因可能为热力烧伤及化学刺激共同作用的结果[9]，目前关于热力烧伤及冲击波致肺损伤的基础研究报道较多[10]，关于气管、支气管损伤的基础研究报道较少[11]；气管、支气管损伤在瓦斯爆炸复合伤诊疗过程中亦有重要作用，但目前关于急性呼吸道阻塞窒息导致死亡的病理过程、气管和支气管损伤与呼吸衰竭的关系以及气管插管等对呼吸道的刺激是否会增加肺部感染等仍不明确，需要进一步研究来验证。目前尚无瓦斯爆炸烧冲复合伤严重程度的评定标准，临床医生仅能分别依据烧伤程度、肺损伤程度及其他部位损伤情况做出临床诊断和处理，导致临床诊疗面临巨大的困难。因此，构建接近瓦斯爆炸现实环境的烧冲复合伤动物模型具有重要意义[12]。

本研究结果显示，实验组大鼠烧冲复合伤发生率为100%；体表烧伤率为100%，其69.7%为体毛烧伤、部分区域结痂，累计皮肤烧伤7只，为Ⅱ度烧伤；另30.3%为体毛轻度烧伤；肺损伤的发生率为100%；死亡19例，死亡率为19.8%。以上结果接近真实瓦斯爆炸伤事故现场情况，证实本管道系统模拟的瓦斯爆炸致烧冲复合伤动物模型稳定可靠[13]。既往文献报道，瓦斯爆炸导致的急性肺损伤病理形态学主要表现为肺水肿，肺毛细血管明显充血，大量炎性细胞、红细胞浸润[4-5,13]，但关于支气管损伤的病理学形态相关报道较少。本研究结果显示，对照组大鼠支气管及肺组织结构正常，无充血水肿情况，表面未见出血点；光镜下可见，肺组织肺泡结构完整，肺泡腔存在、腔内有正常肺泡上皮细胞，肺泡隔内可见结缔组织细胞及毛细血管，支气管黏膜及黏膜肌内组织完整、无充血水肿。实验组大鼠支气管及肺组织颜色加深，支气管黏膜可见散在出血灶，肺组织表面呈点状及片状出血灶；光镜下可见肺泡间隔明显增宽，血管充血、灶状出血，肺泡腔内见淡粉色水肿液。支气管黏膜上皮细胞部分脱落，管壁充血、水肿，中性粒细胞及淋巴细胞浸润，黏膜肌内亦见大量中性粒细胞及淋巴细胞浸润，支气管黏膜腺体腺腔内分泌物增多；提示瓦斯爆炸伤可导致急性呼吸道和肺损伤，存在出血、水肿和炎症细胞浸润。因此，在临床急救过程中除重视肺损伤处理以外，还应充分注意并避免因呼吸道阻塞导致患者窒息死亡以及因气管、支气管损伤导致的其他临床不利因素。

Caspase家族是近年来发现的存在于细胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，主要位于细胞凋亡调控途径的下游，通常以无活性的酶原形式存在于细胞质内，当有致凋亡因素刺激时被激活[14-15]。Caspase-9 是细胞凋亡的主要执行分子[16-17]。瓦斯爆炸后产生的高温、冲击波、有害气体等致伤因素共同作用下可导致气管及肺组织出血、水肿，启动炎症放大效应，大量中性粒细胞被激活后产生和释放超量的活性氧族自由基，从而导致机体抗氧化物质耗竭和氧化应激损伤，氧化应激产生的自由基又引起线粒体损伤[15]，这些因素共同作用可能激活凋亡起始分子caspase-9，进而激活下游的凋亡执行分子caspase-3，继而诱导气管、支气管及肺组织细胞凋亡的级联反应[18]。本研究结果显示，2组大鼠肺组织及支气管组织中均有caspase-3及caspase-9的表达，实验组大鼠支气管和肺组织中caspase-3及caspase-9阳性表达率显著高于对照组。提示细胞凋亡可能是瓦斯爆炸伤烧冲复合伤中支气管、肺损伤的关键病理生理机制之一[19]。

综上所述，本管道系统模拟的瓦斯爆炸烧冲复合伤动物模型与实际瓦斯爆炸现场情况相似，且条件易于控制，重复性佳，可以达到科学研究要求。但仍需探索设计不同瓦斯浓度和容量的管道系统，以达到精准控制气体浓度及爆炸条件，寻找基于炎症、氧化应激、线粒体凋亡、自噬、焦亡等损伤机制和干细胞及其外泌体修复的作用靶标[20-23]，以期为煤矿瓦斯爆炸伤害院前急救护理及临床治疗提供科学依据。