龙葵果多酚物质响应面提取工艺优化及抗氧化分析

石艳宾，耿璐,2，赵雅雯，黄登禹*

1. 天津天狮学院（天津 301700）；2. 天津农学院（天津 300380）

龙葵果是植物龙葵（Solanum nigrumL.）的成熟果实[1]，属于茄科（Solanaceace），又名天茄子、野葡萄、黑天天、苦葵等，具有很高的营养价值和医疗保健作用[2]。龙葵果作为野生资源，成为新兴食品工业的一种重要原料，来生产龙葵果保健饮料、果酱、果酒、罐头等[3-4]。植物多酚享有“健康卫士”的美誉[5-6]，具有抗肿瘤、抗氧化、防治冠心病与中风等心脑血管疾病等作用，属于植物组织中一大类化合物。多酚类物质中的R·OH基，能形成氢自由基（H·），以消除羟自由基（OH·）和超氧阴离子（O2-）等自由基的活性，起到保护组织免受氧化危害的作用，在抗氧化[7]、抑菌、抗病毒、调血脂、降血糖[8]等方面都有很好的成效。Wang等[9]筛选龙葵中的淀粉酶抑制剂，分析龙葵多酚物质抗癌细胞作用，指出龙葵多酚物质具有抗氧化、抗肿瘤、抗糖尿病和抗增殖作用等多种活性。陈凤清等[10]研究指出龙葵果实中的多种抗氧化酶能及时清除体内有氧代谢产生的活性氧等毒害物质，与其他功能物质组成的抗氧化系统，对机体具有保护作用。从野生资源开发利用角度出发，优化龙葵果多酚提取工艺，分析多酚物质的抗氧化性能，为龙葵果的综合开发利用及龙葵果多酚物质的工业化生产提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

晒干龙葵果（市售）；无水乙醇（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）；无水碳酸钠（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）；没食子酸标准品（中国生物制品检定所）；福林酚试剂（生物制剂，上海麦克林生化科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

AR124CN电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；SB3200DTDN超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；DT5-6B低速自动平衡离心机（北京时代北利离心机有限公司）；FW-80高速万能粉碎机（上海科恒实业发展有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 没食子酸标准曲线制作

没食子酸母液的配制。精确称取0.1167 g没食子酸标准品，用蒸馏水定容至100 mL，形成没食子酸储备液。分别吸取1，2，3，4和5 mL没食子酸储备液，用蒸馏水定容至100 mL容量瓶中制成一系列浓度梯度的没食子酸工作液。各吸取1 mL工作液分别加入25 mL具塞比色管中，加5 mL 10%福林酚溶液，静置5 min后加4 mL 7.5%碳酸钠溶液，用蒸馏水定容后静置1 h，在765 nm处测量吸光度。

1.3.2 试验方法

1.3.2.1 多酚物质提取

按照陈佳佳等[11]方法粉碎制备龙葵果待测样品。称取1 g龙葵果粉末，按照一定超声功率、料液比加入不同体积分数的乙醇溶液进行超声辅助浸提[12]，定容至50 mL。将提取多酚溶液在转速4000 r/min条件下离心20 min，制备上清液待测。

1.3.2.2 多酚测定

采用福林酚比色法[13]。取1 mL待测样品溶液于比色管中，加入5 mL 10%福林酚，反应3～8 min内加入4 mL 7.5% Na2CO3溶液，定容至25 mL，用1 mL蒸馏水作为空白对照，1 h后在765 nm处测量其吸光度。多酚得率[14]按式（1）计算。

式中：Y为多酚得率，%；C为多酚质量浓度，mg/mL；V为提取样品溶液总体积，mL；N为稀释倍数；m为龙葵果质量，g。

1.3.3 单因素试验

在料液比1∶30 g/mL、乙醇体积分数60%、超声时间25 min、提取温度30 ℃条件下，研究超声功率（超声波清洗机功率180 W）对多酚得率的影响。超声功率范围60%，70%，80%，90%和100%，分析得到最优超声功率较优水平后，逐个分析乙醇体积分数40%～90%（每个水平间隔10%）、超声提取时间20～45 min（每个水平间隔5 min）、提取温度30～80 ℃（每个水平间隔10 ℃）对龙葵果多酚物质得率的影响，确定超声功率、超声时间、提取温度的最优水平。

1.3.4 响应面试验

根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，在单因素分析的基础上，优化超声波辅助提取龙葵果多酚的工艺条件。以龙葵果多酚得率Y为响应值，乙醇体积分数、超声功率、超声提取温度、超声提取时间为试验因素，设计出四因素三水平的29组试验（中心点试验重复5次），设计因素水平及参数见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素水平编码表

1.3.5 多酚物质抗氧化能力测定

以VC为对照，根据表2将龙葵果多酚提取液、VC溶液配制成10～100 μg/mL浓度的样品溶液，按照表3、式（2）进行DPPH自由基清除能力测定。

表2 样品或VC系列浓度溶液配制

表3 样品溶液DPPH测定方法

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线

以没食子酸标准溶液为横坐标，吸光度作为纵坐标，得到标准曲线。回归方程为y=0.149 8x+0.013 4，R2=0.994 7。

2.2 多酚提取工艺优化

2.2.1 单因素试验

2.2.1.1 超声功率对多酚得率的影响

依据试验方法1.3.2称取龙葵果粉末，固定料液比1∶30（g/mL）、提取温度30 ℃、乙醇体积分数60%、超声浸提25 min，超声功率对龙葵果多酚得率的影响见图2。随着超声功率增加，龙葵果多酚得率先提高而后下降，超声功率达到90%时，多酚化合物含量最高，此时多酚得率为19.08%。随着超声功率增强，超声波振荡加强，样品细胞壁被破坏，多酚的溶出量增加，溶剂进入固体样品内部。超声功率为90%时，多酚基本溶出，继续增加超声功率，多酚结构被破坏，溶出杂质增多，降低超声功率使得溶出多酚不足，龙葵果多酚得率反而降低，因此多酚超声功率90%时最优。

图2 超声功率对多酚得率的影响

2.2.1.2 乙醇体积分数对多酚得率的影响

依据试验方法1.3.2称取龙葵果粉末，固定料液比1∶30（g/mL）、温度30 ℃、超声功率90%、超声辅助浸提25 min，龙葵果多酚得率受乙醇体积分数的影响见图3。乙醇体积分数增加导致龙葵果多酚得率先提高后下降，乙醇体积分数50%时，多酚化合物含量最高，此时多酚得率为19.06 μg/mL。其原因可能是乙醇体积分数大于50%之后越增大，多酚醇溶性越低，从而导致多酚得率下降，故乙醇体积分数50%时最优。

图3 乙醇体积分数对多酚得率的影响

2.2.1.3 超声时间对多酚得率的影响

依据试验方法1.3.2称取龙葵果粉末，在料液比1∶30（g/mL）、乙醇体积分数50%、提取温度30 ℃、超声功率90%条件下进行超声辅助提取，龙葵果多酚得率受超声时间的影响见图4。随着超声时间增加，龙葵果多酚得率逐渐升高，提取时间30 min时，龙葵果多酚得率最高，此时多酚得率为20.74%。因为多酚溶出量随着时间增加而增加，但是超声时间达到30 min时，多酚大部分已溶出；延长超声时间对多酚得率影响不大[15]，反而会使多酚不稳定。因为机械波和热效应的影响，多酚被分解或氧化成其他物质，使得得率降低，因此超声时间30 min时最优。

图4 超声时间对多酚得率的影响

2.2.1.4 超声温度对多酚得率的影响

依据试验方法1.3.2称取龙葵果粉末，在料液比1∶30（g/mL）、乙醇体积分数50%、超声功率90%、超声时间30 min条件下进行超声辅助提取。由图5可知，随着超声温度增加，龙葵果多酚得率出现先上升后下降再趋于平缓趋势。超声温度60 ℃时，龙葵果中多酚得率最高，此时多酚得率为19.38%。因为分子运动随着超声温度增加而增强，龙葵果粉末与乙醇重复接触利于多酚溶出，超声温度到达60 ℃时，大部分多酚溶出，继续升温使多酚分解氧化，会使溶剂大量挥发，从而使多酚得率降低[16]，因此超声温度60 ℃时较优。

图5 超声温度对多酚得率的影响

2.2.2 响应面试验结果与分析

2.2.2.1 响应面试验设计与结果

根据单因素试验结果，选取乙醇体积分数、超声功率、超声温度和超声时间作为考察因素，进行响应面试验，试验结果详见表4。

表4 Box-Behnken试验设计与结果

2.2.2.2 响应面试验结果方差分析

根据表4响应面试验结果进行回归模型方差分析，详见表5。

由表5可知，因素A、B、C、D，交互性AB、BD、CD，平方项A2、B2、C2、D2的p值均小于0.01，表明A、B、C、D因素及交互项AB、BD、CD对龙葵果多酚得率的影响非常显著。交互项AC、BC的p值小于0.05，对多酚得率的影响显著。根据表5中的F值，四个因素影响的大小顺序依次是C＞D＞B＞A，即超声功率＞乙醇体积分数＞超声温度＞超声时间。

表5 回归模型方差与分析

2.2.3 响应曲面图分析

两因素之间交互作用见响应面图6～图11。响应面图均开口向下，说明响应面值具有峰值，并表明其随着因素增大而增大。龙葵果多酚得率受各因素影响越大，响应面图越为陡峭，响应面图越平缓影响越小。各因素之间的交互作用均较大，超声功率与乙醇体积分数之间交互作用不如其他交互作用的影响显著。

图1 没食子酸标准曲线图

图6 超声时间和超声温度对多酚得率的影响

图7 超声时间和乙醇体积分数对多酚得率的影响

图11 超声功率和乙醇体积分数对多酚得率的影响

图8 超声时间和超声功率对多酚得率的影响

图9 超声功率和超声温度对多酚得率的影响

图10 超声温度和乙醇体积分数对多酚得率的影响

2.2.4 验证试验

龙葵果多酚超声波辅助提取工艺利用响应面建立的模型优化参数，得到最优工艺条件：超声时间28.97 min、超声温度50.63 ℃、超声功率82.66%、乙醇体积分数50%，在此条件下多酚提取量预测值为20.27%。为便于实施，实际试验值修正为超声时间29 min、超声温度50 ℃、超声功率83%、乙醇体积分数50%，实际龙葵果多酚得率为20.48%，试验结果与模型符合良好，说明该模型能较好反映龙葵果多酚提取得率。

2.2.5 抗氧化性分析

2.2.5.1 VC对DPPH自由基清除能力分析

由图12可知，随着VC浓度增大，VC对DPPH自由基清除率随着浓度增大上升而后趋于平缓的趋势。VC浓度≤70 μg/mL时，VC清除DPPH自由基的能力随VC浓度增大而明显增大。拟合得到回归方程y= -0.010 1x2+1.777 0x+10.788 3，R2=0.966 4。根据回归方程计算VC半数清除率，IC50=25.87 μg/mL。

图12 VC浓度-清除率关系曲线

2.2.5.2 龙葵果多酚提取液对DPPH自由基清除能力分析

按照响应面优化提取条件制备龙葵果多酚提取液的质量浓度为98.96 μg/mL，依据试验方法1.3.2测定龙葵果多酚物质的DPPH自由基清除率。以多酚样液质量浓度为横坐标，清除率为纵坐标，得到图13龙葵果多酚浓度与DPPH·清除率关系曲线。随着样品浓度增大，多酚样品对DPPH自由基清除率先增大后趋于平缓。样品浓度大于80 μg/mL时，清除DPPH自由基的能力随样品浓度增大而增加缓慢。拟合得到回归方程y=-0.0101x2+1.7770x+10.7883，R2=0.9664。根据回归方程计算得到龙葵果多酚的半数清除率，IC50=22.76 μg/mL。龙葵果多酚的半数清除率IC50小于VC的半数清除率，说明其抗氧化效果比VC更强。

图13 样品多酚浓度-清除率关系曲线

3 结论

龙葵果营养丰富，且含有抗氧化、抗肿瘤、抗糖尿病作用等多种活性成分，成为新兴食品工业的一种重要原料。以龙葵果原料，选取乙醇为提取溶剂，采用超声辅助提取方式提取龙葵果中的多酚物质。对多酚提取得率影响因素主次顺序为超声功率、乙醇体积分数、超声温度、超声时间，且对多酚得率的影响非常显著，交互项AB、BD、CD对龙葵果多酚得率的影响非常显著，交互项AC、BC对龙葵果多酚得率的影响显著。优化工艺条件为超声时间28.97 min、超声温度50.63 ℃、超声功率82.66%、乙醇体积分数50%，龙葵果多酚得率为20.48%，试验结果与模型符合良好。龙葵果多酚的DPPH自由基半数清除率为22.76 μg/mL，低于VC的半数清除率，表明龙葵果多酚具有较强的抗氧化性。龙葵果多酚物质提取与抗氧化试验，将进一步研究多种提取方式协同提取，分析龙葵果多酚物质与其他抗氧化剂的协同作用，为天然复配食品添加剂发展提供参考。