皱皮木瓜内在物质含量及其与土壤环境因子的相关性

徐广，任星宇，罗川，谭秋生，邓才富,罗敏

重庆市药物种植研究所 中药材质量控制研究中心，重庆市道地药材规范化生产工程技术研究中心（重庆 408435）

皱皮木瓜为蔷薇科植物贴梗海棠Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai的干燥近成熟果实，主要分布于我国安徽、山东、湖北、贵州、四川和重庆等地[1]。木瓜药用历史悠久，始载于《名医别录》，列为中品，本品味酸，性温，归肝、脾经，具有平肝舒筋、和胃化湿之功。临床多用于湿痹拘挛、腰膝关节酸重疼痛、吐泻转筋、脚气水肿等症的治疗[2]。现代研究表明，皱皮木瓜是一种集药用、食用和观赏于一身的营养丰富的百益果，富含超氧化歧化酶（SOD）[3]。

中药材质量受产地、生长年限、生长环境以及采收期等众多因素影响，质量稳定性会出现较大差异[4-7]。目前对木瓜化学成分、质量控制、含量测定及药理作用研究报道较多[8-10]，但对其品质差异与主要生长环境因子相关性的研究报道较少。随着近年来农村特色产业结构调整力度加大，木瓜作为药食两用品种在发展中备受推崇，因此研究木瓜生长环境对其内在物质含量的影响，揭示环境因子与其内在物质相关性，对皱皮木瓜产地适宜性具有科学的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

项目团队于2017年对重庆不同生态环境木瓜进行调查采样，采集了不同种植区的木瓜样品及对应植株冠幅范围内10～30 cm层次土壤样品，风干粉碎过0.850和0.150 mm筛，备用。采集样品信息见表1。采样时随机选取3个地块，每个地块分别随机选取3株取样然后混合，作为一组样品。采回的木瓜样品分别投入90～100 ℃开水中，观察木瓜表皮开始泛白立即捞起，然后切2～3 mm厚的薄片，于45 ℃烘干打粉，过0.250 mm筛，备用。木瓜药材和土壤样品编号一一对应。木瓜样品均由重庆市药物种植研究所邓才富研究员鉴定，为蔷薇科植物贴梗海棠Chaenomeles spediosa（Sweet）Nakai的果实。

表1 样品信息

1.2 仪器和试药

LC-20AT高效液相色谱仪（岛津）；KQ-1000DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Centrifuge 5804R高速冷冻离心机（德国，eppendorf）；UV-2450紫外分光光度计（岛津）；SPX-400-Ⅱ恒温培育箱（上海龙跃仪器设备有限公司）；METTLERAL104电子天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；火焰光度计（上海 FP6410）。

色谱纯甲醇（成都科龙化工生产，批号：20130115），熊果酸、齐墩果酸对照品购自中国食品药品检定研究院（批号分别为110742-201622和110709-201607），甲硫氨酸（Met），黑黄素，氯化硝基四氮唑蓝（NBT），聚乙烯吡咯烷酮（PVP），磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）、重铬酸钾、NaHCO3、NH4OAc、甲醇、冰醋酸均为分析纯。

1.3 木瓜内在物质含量测定

熊果酸和齐墩果酸总含量测定：取约0.5 g皱皮木瓜样品细粉，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 KHz）20 min，放冷，再称定质量，用甲醇补重，摇匀，过滤，取续滤液进行HPLC分析。色谱条件：色谱柱，SHISEIDO CAPCELL PAK C18MGⅡ色谱柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流动相，甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（265∶35∶0.1∶0.05，V/V）；检查波长210 nm；流速0.6 mL/min；柱温30 ℃；进样量20 μL。

浸出物含量测定：取约2.0 g皱皮木瓜样品细粉，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50 mL乙醇，密塞，称定质量，静置1 h后连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1 h，放冷，再称定质量，用乙醇补重，摇匀，过滤，精密量取25 mL滤液，置于干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，放冷，迅速精密测定质量，以干燥品计算供试品中醇溶性浸出物的含量（%）。

1.4 木瓜SOD活性测定

1.4.1 SOD提取

称取0.5 g鲜木瓜部位于预冷的研钵中，加2 mL提取介质（50 mmol/L磷酸缓冲液含1%的PVP），在冰浴条件下研磨成均浆，加入提取介质冲洗研钵2～3次，并使最终体积为10 mL，取5 mL均浆液在4 ℃条件下按10 000 r/min离心15 min，上清液即为SOD粗提液。

1.4.2 酶活性的测定

采用氮蓝四唑光还原法[3]，测定560 nm下的吸光度来计算SOD活性，以抑制NBT光还原反应50%所需的酶量为一个酶活性单位。反应体系：Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液50 mmol/L pH 7.8；130 mmol/L Met用磷酸缓冲液配制；750 μmol/L NBT用磷酸缓冲液配制；20 μmol/L核黄素用磷酸缓冲液配制；100 μmol/L EDTA-Na2用蒸馏水配制。

式中：A0为光下对照管吸光度；AS为样品测定管吸光度；Vt为样品提取液的总体积，mL；VS为样品测定取样体积，mL；t为光照反应时间，min；FW为鲜品质量，g。

1.5 土壤养分含量的测定

土壤理化性质指标测定主要参照鲍士旦主编的《土壤农化分析》中的方法。采用重铬酸钾容重法测定土壤有机质；采用碱解扩散法测定碱解氮；采用0.5 mol/L NaHCO3-钼锑抗比色法测定速效磷；采用NH4OAc浸提-火焰光度法测定速效钾。

1.6 数据分析

采用Excel进行数据处理，SPSS 17.0进行方差分析和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质分析

2.1.1 土壤质地与海拔

如表1所示，采样点海拔从377 m到1 349 m等不同海拔均有木瓜种植分布，说明其种植范围海拔跨度较大。采样点的土壤类型有紫色土、紫色夹沙土、紫黄泥、紫色石骨子土、紫色夹沙泥、紫色大土、矿子黄泥、灰包土、棕紫泥、黄泥等10种类型，表明木瓜种植区域广，深受百姓喜爱。

2.1.2 土壤化学性状

如表2所示，所有采样点的pH范围在4.60～8.05之间，土壤从酸性到微碱性跨度大。有机质处于0.99～ 5.665 g/kg之间，平均值为2.623 g/kg，属于六级，肥力比较贫瘠，说明皱皮木瓜在肥力比较贫瘠的土壤中能正常生长。

表2 土壤理化性质

土壤中氮、磷、钾的含量范围分别是68.82～ 434.4，1.6～27.675和68.935～561.67 mg/kg；氮和钾含量处于1～4级之间，磷含量处于2～6级之间，土壤养分分级跨度大，说明皱皮木瓜对土壤养分需求不严格，适应性强。同时可以看出，变异系数最大的是速效磷，达0.95，其次是速效钾、碱解氮、有机质，变异系数分别为0.56，0.48和0.41，pH变异系数最小，为0.15。

2.2 皱皮木瓜内在物质含量分析

表3 皱皮木瓜内在物质含量

指标成分（熊果酸和齐墩果酸）处于0.587%～ 1.552%之间，均超过药典标准要求的不低于0.50%，其中19，23和24号样品的熊果酸含量低于齐墩果酸含量，而其他样品均是熊果酸含量大于齐墩果酸含量；浸出物处于35.15%～50.0%之间，也均超过了药典标准15%的要求；同时其SOD活性都很高，最低活性1 385.38 U，最高活性1 503.33 U。方差分析表明：不同采样点木瓜的熊果酸和齐墩果酸的含量存在显著的差异（p＜0.05）。

2.3 相关性分析

2.3.1 生长环境因子分析

对海拔、土壤pH和N、P、K含量进行了因子分析，提取了3个因子，总方差77.61%的贡献来自这3个因子，见表4。生长因子分析散点图见图1。磷、pH与第一因子有较强相关性，氮、有机质与第二因子有较强相关性。说明土壤养分对皱皮木瓜的内在物质含量有重要影响。

表4 因子分析总方差分解表

图1 生长因子分析散点图

2.3.2 生长环境与皱皮木瓜内在物质相关性分析

皱皮木瓜内在物质与生长环境相关性见表5。结果显示，皱皮木瓜浸出物含量与土壤中碱解氮含量呈显著正相关（p＜0.05），相关系数为0.486；齐墩果酸含量与生长海拔呈显著正相关（p＜0.05），相关系数为0.487；SOD与土壤中速效钾含量呈显著正相关（p＜0.05），相关系数为0.410。

表5 生长环境与木瓜内在物质相关性分析

2.4 回归模型的建立

为建立皱皮木瓜质量品质与生长环境因子关系的数学模型，试验以熊果酸（Y1）、齐墩果酸（Y2）、浸出物（Y3）、SOD（Y4）为因变量，以生长环境因子氮（X1）、磷（X2）、钾（X3）、pH（X4）、有机质（X5）、海拔（X6）为自变量进行逐步回归分析，得方程（2）～（4）：

由回归方程可以看出：对皱皮木瓜齐墩果酸的含量影响最大为海拔高度，二者有显著的正相关关系；土壤碱解氮与皱皮木瓜浸出物含量有显著的正相关关系；土壤速效钾和海拔高度与皱皮木瓜SOD活性呈现显著的正相关关系。研究结果表明，在较高海拔条件下，有利于某些内在物质的合成或累积，同时在生产中适当增加氮、钾肥的施用有助于内在物质的累积提升。

3 讨论

植物次生代谢产物往往是在多种环境胁迫下通过某些机制调控产生的，土壤是植物赖以生长的物质基础，其理化特性对植物的生长发育及其次生代谢产物的积累都有影响。研究环境因子与药材质量之间的相关关系，对于指导开展中药区划和规范化种植等具有重要意义。

皱皮木瓜作为食药两用的木本树体，还具有很高的生态价值，适宜的土壤类型多，海拔跨度大，生长环境多样性，适应性强。此次试验的因子分析中，磷、pH与第一因子有较强相关性；氮、有机质与第二因子有较强相关性。生长环境因子与内在物质相关性表明，木瓜浸出物含量与土壤中碱解氮含量呈显著正相关（p＜0.05），齐墩果酸含量与生长海拔呈显著正相关（p＜0.05），SOD与土壤中有效钾含量及海拔呈显著正相关（p＜0.05）；土壤养分对皱皮木瓜生长有重要影响，而变异系数越小，土壤养分越稳定、越均匀，对植物生长影响越大；变异系数：速效磷＞速效钾＞碱解氮，同时也印证了上述中“碱解氮和速效钾对其内在物质含量的生成有显著正相关作用”的结论。进一步证明皱皮木瓜基地的建设特别需要注意考察土壤氮素和钾素的可供给性，或是在生产中注意氮肥和钾肥的合理施用。因此在实际的生产布局中，可结合具体的药用和食用饮品开发分类布局基地，以药用为主的基地建设，在选址上应更侧重于浸出物含量、熊果酸和齐墩果酸等指标成分的有效积累；以化工、食用饮品开发为主的基地建设，则可更侧重于功能性成分SOD含量更高的区域布局。