海南岛近岸贝类中腹泻性毒素污染情况调查研究

梁琼，张玉霞，赵晓野*，王婷

1. 海南省食品药品检验所海口分所（海口 570311）；2. 海南省工商职业学院（海口 570203）

腹泻性贝毒（diarrhetic shellfish poison，DSP）是由有毒甲藻类鳍藻属（Dinophysis）和原甲藻属（Prorocentrum）中部分藻种产生的一类热稳定的脂溶性多环醚类化合物，主要成分为软海绵酸（oka-daic acid，OA）及其衍生物，因其分布广泛、对人类致毒性强而成为备受关注的海洋生物毒素之一。贝类通过滤食有毒藻类而在体内积累毒素，当人们误食染毒的贝类后就会造成中毒，症状主要表现为腹泻，与一些普通腹泻症状相似，所以往往被人们忽视。由于腹泻性贝类中毒现象普遍存在，且分布较广、致毒性强，故被列为世界食品卫生学重要问题之一。DSP不仅能造成急性中毒，也能引起潜在的慢性中毒，而且DSP中主要成分OA是一种很强的肿瘤促进剂，具有一定的促癌作用[1-2]，可诱发消化系统癌变。尽管致癌机理目前还不十分清楚，但应当引起人们对海产贝类食用安全的高度关注。已有研究报道，我国沿海大部分海域都存在DSP污染[3-5]。南海海域、广东沿海、福建沿海、浙江海域、上海水产市场均发现DSP[6-11]，超标率较高，个别海域超标率竟达77%。

海南岛是我国唯一的热带岛屿，有着丰富的海洋资源和得天独厚的生态环境，为热带贝类养殖提供了有利条件，贝类养殖品种多样化。随着近年来该海域有毒赤潮的不断发生，该海域养殖贝类的食用安全存在较大风险，但关于海洋毒素在海南岛贝类中染毒状况的研究却非常少见[12]，据仅有可查资料显示，胡蓉等[13]研究发现海南岛海域贝类DSP全年阳性检出率和超标率较高，污染状况较为严重。杨美兰等[14]研究发现2006年海南海区的榆林港水域和2007年海南海区的八所港等5个养殖水域牡蛎体中DSP呈阳性。吴施卫等[3]研究发现海南主要的DSP染毒海域是陵水赤控区、海口、莺歌海、三亚及洋浦等地。

此次研究对海南岛常见的贝类设了5个观测点，进行为期一年四季的检测追踪，调查腹泻类贝毒污染状况，为贝类食品安全性评价和毒素检测分析提供基础数据和理论依据，为海南省提高和改善水产品的质量及安全性提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2019年9月至2020年8月为期一年间，在海南省海口（HK）、文昌（WC）、琼海（QH）、三亚（SY）、儋州（DZ）、东方（DF）6个站点进行贝类样品采集，共采集到17种贝类323个样品，主要品种为菲律宾蛤仔、魁蚶、栉江珧、波纹巴非蛤、华贵栉孔扇贝、裂纹格特蛤、翡翠贻贝、钝缀锦蛤、方斑东方螺、蛏子等，均为当地主要经济养殖的贝类。样品采集时了解确认其产地信息，样品采集后迅速送至实验室，用自来水洗去贝类外壳附着物，用刀将贝类的软组织与贝壳分离，并用去离子水冲洗附着内部的壳屑，充分沥干水分，匀浆机均质，编号后置于样品管中，贮存于-24 ℃低温冰箱待测。

1.2 仪器和设备

液相色谱-串联质谱仪（配有电喷雾离子源，Agilent 6460）；PL602L天平（梅特勒）；B-400组织均质器（瑞士步琪）；涡旋振荡器（Heidolph Multi Reax）；3-18K离心机（德国西格玛）；超声波清洗器（昆山舒美KQ-400ES）；YGC-24D氮吹仪（雅源科技）。

1.3 检测方法

试验采用了在GB 5009.212—2016《食品安全国家标准贝类中腹泻性贝类毒素的测定》液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）基础上，实验室进行优化后的方法。取样2 g于50 mL具塞离心管中，加入9 mL甲醇，涡旋混合1 min，超声提取10 min，在8 000 r/min下离心5 min，移出上清液。残渣中加入9 mL甲醇，重复提取1次，合并提取液。将上清液转入分液漏斗中，用15%（体积分数）二氯甲烷/正己烷溶液脱脂3次（每次15 mL），加5 mL水，再用50%（体积分数）二氯甲烷/正己烷溶液萃取3次（每次15 mL），合并二氯甲烷层，用无水硫酸钠脱水后旋转蒸发至近干，然后用氮吹仪吹干，用甲醇定容至1 mL，置于螺纹口样品瓶中，加入125 μL氢氧化钠溶液（2.5 mol/L），混匀后用密封膜将瓶密封，在76 ℃条件下温浴40 min，冷至室温后，加入125 μL盐酸溶液（2.5 mol/L）并混匀，所得水解液（1.25 mL相当于2 g试样）可直接过0.22 μm有机相微孔滤膜后，供液相色谱-串联质谱测定。

1.4 检测条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C182.1×100 mm，1.7 μm；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：5 μL；流动相：A为甲酸铵溶液（2 mmol/L），B为乙腈+甲酸铵溶液（2 mmol/L）（95+5，V/V）；梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）；负离子扫描模式；检测方式：多反应检测（MRM）；电喷雾电压：4 000 V；毛细管温度：300 ℃；各组分监测离子及对应碰撞能量见表2。

表2 DSP监测离子及碰撞能量

1.5 计算方法

OA、DTX-1和DTX-2根据对应标准回归方程进行含量计算。试样中腹泻性贝类毒素总毒力按OAeq=×ri计算。式中：Xi为各种腹泻性贝类毒素的含量；ri为毒性因子（rOA=1，rDTX-1=1，rDTX-2=0.6）。

2 结果与分析

2.1 DSP毒素质谱图

取空白试样，按照与试样相同的分析步骤处理，制成基质标准曲线，如图1所示。

图1 OA标准曲线图

图2 DTX-1标准曲线图

OA、DTX-1，DTX-2的各自的质谱图如图4所示。OA和DTX-2为同分异构体，OA比DTX-2出峰时间早。

图4 OA、DTX-1，DTX-2多反应监测离子色谱图

图3 DTX-2 标准曲线图

2.2 全年DSP污染情况

根据GB 5009.212—2016液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）方法规定，OA、DTX-1，DTX-2的检出限均为10.0 μg/kg，定量限均为30.0 μg/kg，同时方法认为任何腹泻性贝类毒素含量大于16 μg/100 g的样品即被认为是有害的，对人类食用不安全。海南岛近岸腹泻性贝毒污染状况调查结果发现，全年抽样量共323个样品，共有28个样品检出含量超过10.0 μg/kg，其中有6个样品检出含量超过30.0 μg/kg，1个样品超16 μg/100 g。

表3 全年DSP检测情况统计分析

2.3 不同季节贝类DSP毒素污染情况

海南岛近岸贝类DSP含量存在一定的季节差异性。从表4可以看出：2019年冬季，检验贝类样品共59份，DSP检出有12份，检出率为20.3%；2020年春季，检验贝类样品共90份，DSP检出有6份，检出率为6.7%；2020年夏季，检验贝类样品共89份，DSP检出有0份，检出率为0；2019年秋季，检验贝类样品共85份，DSP检出有10份，超标1份，检出率和超标率分别为11.8%和1.2%。贝类DSP含量在冬季检出率最高，秋季次之，染毒含量最高的样品出现在秋季，春季较低，夏季样品都未检出。就检出率而言，2019年冬季＞2019年秋季＞2020年春季＞2020年夏季。

表4 不同季节DSP检测情况统计分析

2.4 不同海域贝类DSP毒素污染情况

海口海域共采集样品54份，DSP检出有7份，超标1份，检出率和超标率分别为13.0%和1.9%；文昌海域共采集样品52份，DSP检出有9份，检出率为17.3%；琼海海域共采集样品54份，DSP检出有1份，检出率为1.9%；三亚海域共采集样品53份，DSP检出有3份，检出率为5.7%；儋州海域共采集样品54份，DSP检出有6份，检出率为11.1%；东方海域共采集样品55份，DSP检出有2份，检出率为3.6%。海南岛近岸贝类都有受贝类DSP毒素污染的状况发生，但总体上毒素含量不高。就检出率而言，文昌＞海口＞儋州＞三亚＞东方＞琼海。如表5所示。

表5 不同海域DSP检测情况统计分析

2.5 不同贝类累积DSP毒素特征

此次调查检测共采集到17种贝类323个样品，主要品种为菲律宾蛤仔41份、魁蚶31份、栉江珧12份、波纹巴非蛤31份、华贵栉孔扇贝12份、裂纹格特蛤53、翡翠贻贝17份、钝缀锦蛤47份、方斑东方螺9份，蛏子29份及其他41份。其他种类贝类均为3～5份，均未检测出贝类DSP毒素。检出率最高的是波纹巴非蛤、华贵栉孔扇贝、翡翠贻贝，高达20%以上，最低是蛏子，检出率从高到低依次为波纹巴非蛤＞华贵栉孔扇贝＞翡翠贻贝＞方斑东方螺＞裂纹格特蛤＞栉江珧＞魁蚶＞菲律宾蛤仔＞钝缀锦蛤＞蛏子=其他。主要品种染毒情况如下表6所示。

表6 不同贝类品种DSP检测情况统计分析

3 讨论

目前贝类毒素检测方法有小鼠生物测定（MBA）法、酶联免疫吸附测定（ELASA）法、高效液相色谱-荧光法、高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）法等。虽然MBA法是腹泻性贝类毒素最普遍的检测方法，但该方法需大量使用小鼠，不符合“3R”的要求[15]，而且由于灵敏度低、准确性和重现性差、易出现假阳性、不具有特异性、无法确定毒素的成分、结构和含量、浪费实验材料等缺点，限制了此方法的推广；ELASA试剂盒虽灵敏度高、操作简单，但其试剂盒昂贵，有类似物干扰作用，会出现假阳性或对毒性估计不准确的情况[16]，不适合日常监测使用；高效液相色谱-荧光法是国内外目前常用的贝类毒素检测方法，分析过程中使用的柱衍生试剂如ADAM价格昂贵[17]，同时还须另配柱后衍生装置，检测所需的荧光试剂在室温下不稳定，背景干扰对试验结果影响大，操作繁琐，不易稳定，重复性差，因此其应用受到一定的限制；此次研究采用了高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）法，该测定方法是近年兴起的一种检测技术，比其他方法重复性好，不会出现假阳性，是一种能够准确定性定量，并能够提供准确的分子结构信息的新型分离技术[18]。在众多的分析测试方法中，HPLC-MS/MS以其同时具备高特异性和高灵敏度的特点而被广泛应用于生物毒素研究领域。

在此次检测的323个样品中，共有28个样品检出含量超过10.0 μg/kg，检出率为8.7%，最大的一个检出含量为180 μg/kg。根据2001-10-01实施的国家标准GB 18406.4—2001《无公害食品水产品中有毒有害物质限量》中规定水产品中DSP限量标准为60 μg/100 g可食部分，可判定该批次无阳性样品。

导致DSP季节性差异的原因可能是季节不同，造成水体温度、盐度、光照等变化，进而影响藻类种群、数量和贝类的生理状态。海南岛海域浮游生物调查发现，该海域存在可能产生DSP的藻类有利玛原甲藻和D.caudata等[19]，且浮游植物细胞密度的季节变化呈冬季初期最高、秋季次之、夏季最低的趋势[20]。此次研究发现冬季检出率最高、秋季次之、春季较低、夏季样品都未检出。海南岛海域贝类中DSP的季节性变化与浮游植物的季节变化间可能存在一定联系。而黄翔等[4]通过分析南海海域赤潮高发期，得出南海海域近岸贝类DSP毒素阳性检出率和超标率在春季较高。海南岛东线海域属于南海海域，而西线却在北部湾海域，这也可能是造成与之不一样的原因。根据胡蓉等[13]的调查研究，其对不同贝类品种的季节性差异的分析，可以得出不同的贝类品种季节性的染毒情况不一样，这也可能是取样不同品种数量的多少，导致贝类季节性差异不一样的结果。

海南岛不同海域，由于潮流和风浪的作用，可能对形成赤潮的浮游生物有很大影响。基于风浪和潮流条件，海南岛东南海域扩散条件不如西北海域，同时一些海湾存在沿岸流，不仅输送浮游生物所需的营养物质，还可能携带形成赤潮的浮游生物，因此海南岛东南部的浮游甲藻较多。在此次调查中，东线海岸比西线海岸检出率高，含量最高的出现在海口海域，检出率最高是文昌。在海南岛贝类养殖中，文昌养殖面积最大，产生大量污染物流入近岸，海域营养化，促使产毒藻类富集，增加该海域贝类染毒概率。此外沿海城市经济的快速发展，使大量污染物排放到周围水体，造成海水营养化导致赤潮发生，因此经济发达的省市污染状况往往更严重，这可能是含量最高的出现在海口海域的原因。

贝类的种类对DSP的积累存在差异性。贝类自身对DSP吸摄食率以及对毒素吸收和代谢能力，是影响贝类DSP积累的重要因素之一。Viviani[21]研究发现，贻贝积累DSP的能力最强、扇贝次之、牡蛎的能力最弱。徐志斌等[8]研究发现翡翠贻贝和牡蛎染毒比例大，而吴施卫等[7]在检测的样品中发现波纹巴非蛤超标情况最多。杨美兰等[14]对南海海域牡蛎体中的DSP进行调查，结果表明牡蛎是较易积累DSP的。此次研究结果显示波纹巴非蛤检出率最高，华贵栉孔扇贝和翡翠贻贝次之，因此波纹巴非蛤、华贵栉孔扇贝和翡翠贻贝较易累积DSP。有研究发现：有的贝类在摄食有毒藻后，累积毒素而中毒死亡；有的种类会不同程度地关闭贝壳膜瓣，收缩水管，降低摄食率就减少毒素累积；而有的种类则未发生异常反应。因此，导致贝类体内所含毒素不同[8,21]，所以不同贝类积累DSP存在一定的差异性。

总之，从监测结果上看，海南岛近岸DSP的检出率较低，污染状况虽然不是很严重，但贝毒本身在环境中存在，食用安全的潜在风险不容忽视，对人类的影响有待进一步研究。为了更全面了解该地区贝类毒素的特征，需要在更大的海区范围内选取更多的贝类进行监测，以确保其质量和安全性，保障人们的饮食和生命安全。