HPLC法同时测定小儿七星茶颗粒中9种钩藤成分

陈素云， 周 恒， 赵晓彤， 曹依敏， 黄晓静， 季 申*

(1.上海中医药大学中药学院，上海 201203；2.上海市食品药品检验研究院，国家药品监督管理局中药质量控制重点实验室，上海 201203)

小儿七星茶颗粒是常用小儿消食药，由薏苡仁、山楂、稻芽、淡竹叶、钩藤、蝉蜕、甘草7味中药组成，具有开胃消滞、清热定惊的功效，临床上主要用于小儿积滞化热、消化不良、夜寐不安等症状的治疗[1]，收载于2020年版《中国药典》一部，但现行标准仅对方中甘草、山楂药味规定了薄层鉴别、含量测定等项目[2]。课题组前期发现，小儿七星茶颗粒中归属于钩藤的主要色谱峰数量与甘草相当，远多于其他药味，但目前缺乏对其所含成分的专属质量控制方法。因此，本实验在前期研究的基础上结合文献[3-5]，建立HPLC法同时测定小儿七星茶颗粒中喜果苷、二氢卡丹宾、异去氢钩藤碱、去氢钩藤碱、异钩藤碱、钩藤碱、去氢毛钩藤碱、毛钩藤碱、缝子嗪甲醚9种钩藤成分的含量，以期为该制剂的质量控制提供依据。

1 材料

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；XSE105电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；Elmasonic E100H超声波清洗仪(德国Elma公司)；Milli-Q型超纯水系统(美国Milipore公司)。喜果苷对照品(上海同田生物技术股份有限公司，批号20081424，纯度99.4%)；二氢卡丹宾(批号6072，纯度98.2%)、异去氢钩藤碱(批号2557，纯度99.9%)、去氢钩藤碱(批号4075，纯度98.9%)、去氢毛钩藤碱(批号4170，纯度98.9%)、毛钩藤碱(批号6068，纯度98.9%)、缝子嗪甲醚(批号6069，纯度98.1%)对照品(上海诗丹德生物技术有限公司)；异钩藤碱(批号111927-201102)、钩藤碱(批号112028-201601)对照品(中国食品药品检定研究院)。小儿七星茶颗粒共56批(编号1～56)，均为市售，具体信息见表1，缺钩藤阴性样品由相关企业提供。乙腈、甲醇为色谱纯(德国Merck公司)；二乙胺、氨水为分析纯(上海凌峰化学试剂有限公司)。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent Extend C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.015%二乙胺(B)，梯度洗脱，程序见表2；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长246 nm；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取喜果苷、二氢卡丹宾、异去氢钩藤碱、去氢钩藤碱、异钩藤碱、钩藤碱、去氢毛钩藤碱、毛钩藤碱、缝子嗪甲醚对照品适量，加乙腈制成每1 mL各含1 mg上述成分的贮备液，精密量取适量，甲醇定容至20 mL，即得(质量浓度为50 μg/mL)，并用甲醇逐级稀释至1、2、5、10、20 μg/mL，在4 ℃下保存。

2.2.2 供试品溶液 取本品粉末约5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50 mL甲醇，称定质量，超声(功率300 W、频率40 kHz)处理30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 mL，水浴蒸至近干，残渣加甲醇溶解并定容至2 mL，摇匀，微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按工艺及处方制备缺钩藤的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察 精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液各10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

1.喜果苷 2.二氢卡丹宾 3.异去氢钩藤碱 4.去氢钩藤碱 5.异钩藤碱 6.钩藤碱 7.去氢毛钩藤碱 8.毛钩藤碱 9.缝子嗪甲醚1.vincosamide 2.3α-dihydrocadambine 3.isocorynoxeine4.corynoxeine 5.isorhynchophylline 6.rhynchophylline7.corynantheine 8.hirsutine 9.geissoschizine methyl ether图1 各成分HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项下不同质量浓度对照品溶液各10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表3，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表3 各成分线性关系考察

2.3.3 精密度试验 精密吸取10 μg/mL对照品溶液10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得喜果苷、二氢卡丹宾、异去氢钩藤碱、去氢钩藤碱、异钩藤碱、钩藤碱、去氢毛钩藤碱、毛钩藤碱、缝子嗪甲醚峰面积RSD分别为0.2%、0.3%、0.4%、0.1%、0.7%、0.4%、0.2%、0.7%、0.2%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验

2.3.4.1 对照品溶液 精密吸取10 μg/mL对照品溶液10 μL，于0、1、2、3、4、24 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得喜果苷、二氢卡丹宾、异去氢钩藤碱、去氢钩藤碱、异钩藤碱、钩藤碱、去氢毛钩藤碱、毛钩藤碱、缝子嗪甲醚的峰面积RSD分别为0.4%、0.4%、1.3%、0.8%、2.9%、2.5%、0.3%、0.6%、0.3%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.4.2 供试品溶液 取本品粉末(编号4)适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，于0、1、3、15、24 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，除异去氢钩藤碱未检出外，测得喜果苷、二氢卡丹宾、去氢钩藤碱、异钩藤碱、钩藤碱、去氢毛钩藤碱、毛钩藤碱、缝子嗪甲醚峰面积RSD分别为1.2%、1.5%、1.2%、2.1%、0.2%、0.4%、0.8%、0.8%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验 取本品粉末(编号4)适量，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，除异去氢钩藤碱未检出外，测得喜果苷、二氢卡丹宾、去氢钩藤碱、异钩藤碱、钩藤碱、去氢毛钩藤碱、毛钩藤碱、缝子嗪甲醚含量RSD分别为2.1%、2.5%、3.7%、1.3%、1.5%、1.4%、1.3%、1.3%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 精密称取本品粉末(编号4)2.5 g，共9份，置于具塞锥形瓶中，以3份为一组，每组分别精密加入50 μg/mL对照品溶液0.25、0.5、1 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，喜果苷、二氢卡丹宾、异去氢钩藤碱、去氢钩藤碱、异钩藤碱、钩藤碱、去氢毛钩藤碱、毛钩藤碱、缝子嗪甲醚平均加样回收率分别为95.3%、92.6%、97.4%、98.6%、91.6%、104.9%、97.3%、94.9%、95.7%，RSD分别为5.2%、4.0%、1.8%、5.5%、2.5%、2.8%、2.7%、4.0%、3.8%。

2.4 样品含量测定 取56批样品，按“2.2.2”项下方法各平行制备2份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表4。

表4 各成分含量测定结果(μg/g，n=2)

3 讨论

3.1 色谱条件选择 本实验考察了Extend C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、XBridge C18(4.6 mm×100 mm，3.5 μm)、XBridge Shield RP 18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、TechMate C18ST(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，发现Extend C18柱对9种钩藤成分的分离效果最优。再比较了乙腈-0.015%二乙胺[4]、甲醇-0.1%三乙胺(冰醋酸调pH值7.5)[6-8]，最终确定前者作为流动相。

3.2 对照品稀释溶剂选择 钩藤中部分生物碱的稳定性较差，对溶剂较敏感，容易发生互变异构[9-12]。本实验考察了甲醇、70%甲醇对9种钩藤成分稳定性的影响，最终确定前者作为对照品稀释溶剂。

3.3 供试品提取溶剂选择 本实验考察了甲醇、1%氨水甲醇、氨水-二氯甲烷-甲醇(1∶5∶5)[13]、氨试液-三氯甲烷(2∶7)[14]的提取效果，最终确定甲醇作为供试品提取溶剂。

3.4 含量分析 11个厂家56批样品中9种钩藤成分的种类和含量存在较大差异，而且有2批未检出所有成分，可能与药材质量、生产工艺等因素有关，值得关注。

4 结论

本实验首次建立HPLC法同时测定小儿七星茶颗粒中喜果苷、二氢卡丹宾、异去氢钩藤碱、去氢钩藤碱、异钩藤碱、钩藤碱、去氢毛钩藤碱、毛钩藤碱、缝子嗪甲醚9种钩藤成分的含量，该方法操作简便，准确度高，重复性好，可为该制剂的质量控制及评价提供科学依据。