超声波辅助提取水芹中总黄酮的工艺研究

万国福，张 倩，谢雅薇，陈 文，田吉麒，张 兰

（江苏食品药品职业技术学院，江苏淮安 223003）

水芹（Oenanthe javanica）又名水芹菜，别名水英、牛草、楚葵、刀芹、蜀芹、野芹菜等，属于伞形科、水芹菜属，为多年水生宿根草本植物。水芹含有丰富的维生素、矿物质、纤维素、芸香苷、水芹素、檞皮素及黄酮类化合物等多种营养物质和活性成分[1]，对人体机体功能存在广泛有益的影响。水芹味甘辛、性凉、入肺、胃经，有清热解毒、养精益气、清洁血液、降低血压、宣肺利湿等功效[2]，其中所含黄酮类化合物作为一种天然抗氧化剂，更具有抑菌、抗衰老和抗病毒等作用[3-4]。以水芹为原料，利用乙醇提取法提取总黄酮，通过分析超声辅助干预处理的影响因素，运用SPSS Statistics 17.0 软件进行正交试验优化最佳提取条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料

水芹，产地淮安。

1.1.2 试剂

芦丁、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、无水乙醇等均为国产分析纯。

1.1.3 仪器

UV754 型紫外可见分光光度计，北京普析仪器有限公司产品；DHG-9245A 型电热恒温鼓风干燥箱，上海跃核仪器有限公司产品；高速粉粹机，天津市泰斯特仪器有限公司产品；GN-100Y 型超声波细胞粉碎机，上海谷宁仪器有限公司产品。

1.2 水芹总黄酮提取工艺

水芹→清洗→55 ℃烘干→打粉→样品称量→料液比配制→超声波处理→离心取上清液→提取、测定。

1.3 总黄酮测定方法

1.3.1 标准曲线制作

精确称取烘干至恒质量的芦丁标品10 mg，加入适量体积分数70%的乙醇溶液中，水浴溶解，冷却后用体积分数70%乙醇溶液定容至100 mL，配制得质量浓度为0.1 mg/mL 的芦丁标准溶液。分别准确量取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL 芦丁标准溶液，分别置于10 mL 的比色管中，依次加入体积分数70%乙醇溶液补足5 mL，加入质量分数5%的亚硝酸钠溶液0.1 mL，混匀后静置5 min，再加入质量分数为10%的硝酸铝溶液0.1 mL，摇匀后再静置6 min，然后加入浓度为1 mol/L 的氢氧化钠溶液3 mL。最后用体积分数70%的乙醇溶液定容至10 mL，混匀，静置10 min 后，于波长510 nm 处测定吸光度[3-5]。

芦丁标准曲线见图1。

图1 芦丁标准曲线

1.3.2 水芹黄酮提取与测定

在室温条件下，准确称取1 g 的水芹干粉进行超声波处理后，提取总黄酮并计算黄酮提取率。

式中：C——试样的测定质量浓度，mg/mL；

m——样品质量，g；

n——稀释倍数；

V——滤液体积，mL。

1.4 试验设计

1.4.1 单因素试验

准确称量若干份水芹干粉1 g，分别以乙醇体积分数（30%，40%，50%，60%，70%），料液比（1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1∶70），超声功率（200，250，300，350，400 W），超声时间（20，30，40，50，60 min）进行单因素试验处理[6-8]，利用1.3 测定方法提取并计算黄酮提取率，研究各因素对水芹菜中总黄酮提取量的影响。

1.4.2 正交试验

依据上述单因素试验结果，选择各因素最佳处理条件设计L9（34）正交试验。

正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素与水平设计

2 结果与分析

2.1 乙醇体积分数的选择

乙醇体积分数对水芹中总黄酮提取率的影响见图2。

图2 乙醇体积分数对水芹中总黄酮提取率的影响

水芹中所含的黄酮类化合物极性较大，依据“相似相溶原理”极性溶剂乙醇的不同体积分数对黄酮类化合物提取有较大影响。由图2 可知，水芹总黄酮提取率随乙醇体积分数不断增加，呈现先增加后降低的趋势。当乙醇体积分数为60%时，总黄酮提取率最高。因此，选择水芹中总黄酮提取的最佳乙醇体积分数为60%。

2.2 料液比的选择

料液比对水芹总黄酮提取率的影响见图3。

图3 料液比对水芹总黄酮提取率的影响

水芹干粉与水的混和比例对总黄酮提取也有较大影响。由图3 可知，料液比总黄酮提取率与料液比之间呈现先增加再降低的趋势，当料液比为1∶40时，水芹中总黄酮提取率最高，伴随水的加入量不断增加即料液比逐渐变小，黄酮提取量也逐渐下降。因此，选择水芹中总黄酮提取的最佳提取料液比为1∶40。

2.3 超声功率的选择

超声功率对水芹总黄酮提取率的影响见图4。

由图4 可知，在相同的超声作用时间内，当超声波功率由200～350 W 变化时，随着超声波功率的增加，总黄酮的溶出量越高，提取率也越高。当超声功率为350 W 时，水芹中总黄酮提取率达到最大值，若超声波功率继续增大，则总黄酮提取率开始呈下降趋势。因此，选择水芹中总黄酮提取的最佳超声功率为350 W。

图4 超声功率对水芹总黄酮提取率的影响

2.4 超声时间的选择

超声时间对水芹总黄酮提取率的影响见图5。

图5 超声时间对水芹总黄酮提取率的影响

由图5 可知，在一定条件下，当超声功率相同时，超声时间越长，总黄酮的溶出量越高，提取率也越高。当超声作用时间达到50 min 时，水芹中的总黄酮提取率达到最大值，若继续延长作用时间，总黄酮提取率则会出现微弱下降。因此，选择水芹中总黄酮提取的最佳超声时间为50 min。

2.5 黄酮提取工艺的优化

根据单因素试验结果，选取乙醇体积分数、料液比、超声时间、超声功率4 个因素利用SPSS Statistics 17.0 软件进行正交试验。

正交试验结果见表2，正交设计方差分析结果见表3。

表2 正交试验结果

表3 正交设计方差分析结果

由表2 可知，试验4（A2B1C2D3）组合最好，直观分析获得的最佳试验组合为A3B1C3D3，即乙醇体积分数70%，料液比1∶30，超声时间60 min，超声功率400 W。各因素的影响次序为B＞D＞A＞C，即料液比＞超声功率＞乙醇体积分数＞超声时间。

由表3 可知，乙醇体积分数、料液比、超声时间和超声功率4 个因素中，料液比和超声功率2 个因素为差异极显著，而乙醇体积分数和超声时间2 个因素为差异显著。从软件分析结果可知，料液比对提取率影响最大，其次是超声功率、乙醇体积分数和超声时间，与直观分析结果相一致。

将最佳试验组合A3B1C3D3进行3 次重复验证试验，得到水芹总黄酮提取率平均值为0.874 mg/g。故最终选择组合A3B1C3D3，即乙醇体积分数70%，料液比1∶30，超声时间60 min，超声功率400 W 作为水芹中总黄酮超声波辅助提取工艺的最佳条件。

3 结论

在室温条件下，通过单因素试验分析乙醇体积分数、料液比、超声时间、超声功率4 个影响超声波辅助提取总黄酮的因素，确定出各因素的最佳工艺条件为乙醇体积分数60%，料液比1∶40，超声功率350 W，超声时间50 min。在此基础之上，进一步通过正交试验对超声波辅助提取水芹中总黄酮工艺条件进行优化，得出最佳工艺参数为乙醇体积分数70%，料液比1∶30，超声时间60 min，超声功率400 W。在该工艺条件下水芹中总黄酮的提取率可达0.874 mg/g。