吉林地区非结核分枝杆菌菌种鉴定情况分析

高菲 周亚丽

摘  要：目的  了解吉林地区非结核分枝杆菌（NTM）病的确诊率及各菌种所占比例、地域性特点及分布情况，对本地区NTM病的诊断、治疗和整体防治规划起到至关重要的作用。方法  采集2017～2019年吉林地区的NTM菌株3768株，采用分枝杆菌基因组快速提取试剂盒和猎阵分枝杆菌（16种）菌种鉴定试剂盒（膜芯片法），对NTM进行基因分型，鉴定到分枝杆菌种属，以便临床医生对患者更合理用药进行治疗，避免耽误最佳治疗时期。结果  2017～2019年吉林地区NTM病确诊率分别为0.68/10万、0.86/10万、1.19/10万;在3768株分枝杆菌中，NTM病所占比例为2.68%（101/3768）;将101例NTM病的菌株进行菌型鉴定，占比最多的是胞内分枝杆菌，为40.59%（41/101），其次为堪萨斯分枝杆菌，为26.73%（27/101）;地域分布：2017～2019年农村的确诊率为3.23/10万，城市的确诊率为1.55/10万;年龄分布：60岁以上NTM病患者占72.3%（73/101）。结论  吉林地区NTM病确诊率近几年呈上升趋势，地域性分布特点为农村高于城市;感染人群以老年人居多，本地区NTM病致病菌以胞内分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌为主。

关键词：非结核分枝杆菌;菌种鉴定;PCR分子生物学技术

中图分类号：R446.5 文献标识码：A 文章编号：1009-8011（2022）-11-00-03

非结核分枝杆菌（NTM）是指除结核分枝杆菌复合群（包括人型分枝杆菌、牛型分枝杆菌、非洲型分枝杆菌、田鼠型分枝杆菌）和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌[1]。近年来，NTM病呈快速增多趋势，并且已经成为威胁人类健康的重要公共卫生问题。为应对NTM病日益增多的形势，提高对NTM病的诊断治疗和整体预防控制水平，减少NTM对人类生命健康的威胁。中华医学会结核病学分会于2012年撰写了《非结核分枝杆菌病诊断与治疗专家共识》，详细介绍了世界各国NTM病的发病情况和流行趋势。我国近年来尚未有大样本NTM病的流行病学调查资料。1990年和2000年全国结核病抽样流调结果显示，NTM分别为4.9%和11.1%，在发现的NTM中具有致病性的就有30余种，我国沿海地区的NTM发病率要远远高于内陆地区，并且致病的NTM种类也不相同[2]。了解本地区NTM病的确诊率及各菌种所占比例及流行趋势情况，并对患者信息进行统计和分析，得出相应结论，对本地区NTM病的诊断、治疗、预防控制及防治规划的制定起到至关重要的作用。本研究对吉林地区2017～2019年全部分枝杆菌培养阳性菌株（3768株）进行鉴定、基因分型，鉴定到分枝杆菌种属。现报道如下。

1  资料与方法

1.1  一般资料

收集吉林地区2017～2019年保留的分枝杆菌培养阳性菌株，共3768株（来源包括吉林地区9个县市区结防所、吉林市结核病防治研究所全部结核网报患者培养阳性菌株），用传统方法进行菌种鉴定，同时采用结核分枝杆菌基因组快速提取试剂盒和猎阵分枝杆菌（16种）菌种鉴定试剂盒，进行基因分型实验，鉴定NTM到分枝杆菌种属。

1.2  实验方法

（1）结核分枝杆菌基因组快速提取。吸取1 mL已灭菌的菌液加入到裂解管中离心5 min;吸弃上清（吸弃玻璃珠层以上液体，吸弃液体时不要碰到玻璃珠）;在裂解管中加入100 uL裂解液TF（TF每次使用时要摇匀并即刻取用）;恒温振荡仪上水平振荡10 min，95 ℃;离心3 min，上清即为分枝杆菌提取的基因组，可作为聚合酶连反应（PCR）扩增模板。2～8 ℃保存。（2）猎阵分枝杆菌（16种）菌种鉴定。①PCR扩增：扩增体系为20 uL，即将17 uL扩增反应液和3 uL模版DNA分别加入PCR管中，涡旋离心数秒备用。扩增程序为50 ℃、2 min;95 ℃、4 min;（94 ℃、30 s，53 ℃、45 s，72 ℃、20 s）、35个循环;（94 ℃、30 s，68 ℃、45 s，72 ℃、20 s）、20个循环;4 ℃，hold。完成扩增反应后，PCR产物可立即检测，如果不能立即检测则置于-18 ℃以下保存，并且在1周内完成检测。②分枝杆菌菌种鉴定膜芯片检测：按照仪器及试剂盒说明书进行操作。（3）判读分枝杆菌的种类。当膜芯片上2条阳性质控（HC、PC）探针均为阳性，阴性质控（NC）探针阴性时，认定本次结果有效。然后将各菌种鉴定探针的显色斑点位置的结果与表1进行比对。结果判读见表1。

1.3  观察指标

当膜芯片上HC、PC探针位置正常显色，且NC探针位置为阴性时，根据膜芯片上显色斑点的位置，读取相应的检测结果。若NTM探针出现显色位点，NTM菌种鉴定探针同时出现显色点，则说明为相应的NTM为阳性。例如：膜芯片上HC、PC探针位置正常显色，NC探针位置为阴性时，NTM探针位置出现显色斑点，同时，堪萨斯分枝杆菌探针位置也出现显色斑点，则可以判定，该NTM菌种鉴定为堪萨斯分枝杆菌。若NTM探针出现显色斑点，NTM菌种鉴定探针位置没有出现显色斑点，则说明可能为检测范围外的其他分枝杆菌。例如：膜芯片上HC、PC探针位置正常显色，NC探针位置为阴性时，NTM探针位置出现显色斑点，而NTM菌种鉴定探针没有出现显色斑点，则可以判定该患者感染了NTM，并且是檢测范围外的其他分支杆菌。若结核分枝杆菌（MTB）探针出现显色位点，则说明结核分枝杆菌复合群阳性。即膜芯片上HC、PC探针位置正常显色，NC探针位置为阴性时，MTB探针位置出现显色斑点，则可以判定该患者感染了MTB。若菌种鉴定探针出现多个显色位点，则说明为多种分枝杆菌阳性。例如：膜芯片上HC、PC探针位置正常显色，NC探针位置为阴性时，MTB探针位置出现显色斑点，同时，NTM探针位置出现显色斑点，并且胞内分枝杆菌探针位置也出现显色斑点，则可以判定该患者混合感染了MTB和NTM，并且该NTM菌种鉴定为胞内分枝杆菌。通过肉眼判读膜芯片上的显色斑点位置，判定NTM菌种类型，分别统计数量，计算出吉林地区NTM病的确诊率及各菌种类型所占比例，并且对患者信息进行统计分析，得出NTM病的地域分布情况及年龄结构情况。

2  结果

2017～2019年吉林地区分离培养阳性菌株3768株，对所有分离培养阳性菌株同时进行传统方法菌型鉴定和PCR分子生物学技术（分枝杆菌菌种鉴定膜芯片法）的菌种鉴定，传统方法菌型鉴定出的MTB株数为3661株，NTM株数为100株，实验污染为7株;PCR分子生物学技术鉴定出的MTB株数为3772株，NTM株数为101株，其中5株菌株利用分子生物学方法检测MTB和NTM都存在。经重复试验，判定这5株菌株为MTB和NTM混合感染，传统方法菌型鉴定与PCR分子生物学技术鉴定具有较高的一致性。

将3768株菌株，经过分枝杆菌菌种鉴定膜芯片检测进行菌型鉴定后，NTM株数为101株，在全部分枝杆菌中，NTM所占比例为2.68%（101/3768），按照年份统计，2017年25例、2018年32例、2019年44例，按照吉林地区人口370万、分离出NTM菌株的人数计算（NTM病确诊率=NTM病培养阳性人数/总人口数×100000/10万），2017～2019年吉林地区NTM病确诊率分别为0.68/10万、0.86/10万、1.19/10万。对比分析得出，2017～2019年吉林地区NTM病的确诊率呈逐年上升趋势。

在101株NTM菌株中，胞内分枝杆菌为41株，所占比例为40.59%（41/101）;堪萨斯分枝杆菌为27株，所占比例为26.73%（27/101）;鸟型分枝杆菌5株，所占比例为4.95%（5/101）;耻垢分枝杆菌和脓肿分枝杆菌均为4株，所占比例均为3.96%（4/101）;偶然分支杆菌和次要分枝杆菌均为2株，所占比例均为1.99%（2/101）;其他NTM（膜芯片法检测范围以外的其他分枝杆菌）为16株，所占比例为15.84%（16/101）。其中5例为混合感染菌株，4例为人型分枝杆菌与胞内分枝杆菌混合感染，1例为人型分枝杆菌与脓肿分枝杆菌混合感染。

将101例NTM病患者的信息进行统计，地域分布：2017～2019年农村确诊率为3.23/10万（84例患者，260万人口），城市确诊率为1.55/10万（17例患者，110万人口），吉林地区NTM病的地域性分布特点为农村人口确诊率高于城市人口确诊率;年龄分布：60岁以上73例，40～59岁22例，40岁以下6例，吉林地区NTM病感染人群是老年人多于年轻人。

3  讨论

由NTM感染导致的疾病统称NTM病，NTM病与结核病有相同或高度相近的病原菌形态、临床特点、病理和影像特点，在结核病高负担国家，NTM病误诊成结核病屡见不鲜[3]，甚至因治疗效果不佳归类于耐药结核病或致多系统传播性感染[4-5]。当患者出现抗结核治疗效果差，反复抗酸杆菌检测阳性时，医生要考虑是NTM的感染，应该对标本进行分子生物学方法检测[6-8]。

2017～2019年吉林地区NTM病确诊率分别为0.68/10万、0.86/10万、1.19/10万。目前NTM病是以NTM培养阳性为临床诊断标准，NTM培养阳性患者为确诊患者[1，9]。吉林地区NTM病的确诊率呈逐年上升趋势，分析原因：临床医生对NTM病的认识提高;实验方法的改进和新技术的应用，尤其是PCR检测技术应用于菌种鉴定，大大提高检出率;以及高龄人群、艾滋病患者等易感人群的增多使NTM病确诊率有所升高[10]。地域不同，NTM菌株流行分布特点不同。我国不同地区的相关研究结果显示，常见的致病性NTM为鸟-胞

内分枝杆菌复合体、脓肿分支杆菌、堪萨斯分枝杆菌[11-12]。有研究显示，我国北方是NTM病的多发地区，最常见NTM为胞内分枝杆菌[13]。本研究中的101株NTM，最多的是胞内分枝杆菌，比例为40.59%，其次为堪萨斯分枝杆菌，比例为26.73%，与我国北方菌株流行分布特点一致。对NTM病患者信息进行统计，吉林地区NTM病的地域性分布特点为农村发病率高于城市，其原因可能与生活习惯、自然环境及饮用水有关，使农村人口在NTM环境中的暴露机会远大于城市人口。NTM病感染人群是以60岁以上的老年人为主，主要是老年人既往有慢性疾病者偏多，或长期应用激素致使机体抵抗力下降，导致一部分条件致病菌感染致病。

关于NTM病的治疗，以胞内分枝杆菌病的治疗为例，大多数一线抗结核药物，比如异烟肼和吡嗪酰胺，对胞内分枝杆菌都天然耐药，药物对胞内分枝杆菌的体外活性比对结核分枝杆菌的体外活性降低10～100倍，而大环内酯类药物（克拉霉素和阿奇霉素）却是胞内分枝杆菌治疗中不可替代的药物，是胞内分枝杆菌病治疗的核心药物[14-15]。2020年新版胞内分支杆菌属肺病诊疗指南[16]推荐，初治患者采用“克拉霉素+利福霉素+乙胺丁醇”三药联合方案，对于进展性、难治性的耐药患者可酌情增加氨基糖苷类药物。也有研究显示莫西沙星是抗胞内分枝杆菌属作用最强的氟喹诺酮类药物[17]。NTM病的治疗要遵循的重要原则是要在NTM菌种鉴定基础上选择合理的治疗方案，做到不同的NTM病应给予不同的治疗方案。

综上所述，在重点人群中及时筛查诊断，选择适当治疗方案是降低NTM对高危人群健康危害的最有效手段。因此，鑒别MTB和NTM，并对NTM进行菌型鉴定，指导临床医生做出准确的诊断，避免耽误最佳治疗时期，对NTM病患者给予准确治疗方案减轻负担，以及对NTM病的防治规划制定都起到至关重要的作用。

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