原代人口腔角质细胞在产黑普氏菌作用后的转录组分析

口腔扁平苔藓（oral lichen planus，OLP）是口腔黏膜病专科中最常见的疾病之一，最新研究表明整体发病率在0.89%左右

。目前OLP 发病机制尚不明确，普遍认为OLP 是机体内在与外在因素联合作用引发的疾病。在一些外在因素（病原体、药物、牙科材料等）作用下，易感人群口腔黏膜病损部位的上皮细胞与抗原呈递细胞活化，这些细胞分泌多种炎症因子与趋化因子，激活T 淋巴细胞，形成持续存在的免疫炎症反应

。在OLP 患者的唾液、组织及颊黏膜拭子中发现了菌群失调的现象

，菌群失调可能在OLP 发生发展过程中起到重要作用

。本课题组前期研究发现，OLP 组颊黏膜表面微生物菌落结构与健康对照组相比发生显著性改变，其中产黑普氏菌（

，

.

）在OLP 组颊黏膜表面构成比显著增加，且该菌能够侵入到OLP 病损组织上皮层及固有层，并与巨噬细胞相互作用，提示

.

可能在OLP 的发生发展中起到重要作用

。而口腔黏膜上皮角质形成细胞作为抵抗外界入侵的第一道屏障，

.

与口腔上皮角质细胞的相互作用并不清楚。

转录组测序是对特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA 的总和进行高通量测序。通过新一代高通量测序，能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息。目前，对OLP 转录组研究并不完善，多集中于OLP 的癌变倾向

、OLP 的炎症反应过程

等。有关口腔共生菌作用下，口腔上皮角质形成细胞转录组的改变目前尚无研究。因此本研究利用转录组测序技术，研究原代人口腔角质形成细胞（primary human oral keratinocytes，pHOKs）在

.

刺激下基因表达的改变，对差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）进行生物信息学分析，并筛选其中的差异基因进行验证，为探究DEGs 所参与的通路与OLP 的相关性提供实验基础。

分别计算(xp1,yp1)、(xp2,yp2) 、(xp3,yp3)、(xp4,yp4)的距离差值d,取d(i)的最小值对应的坐标作为改进灰狼算法的初始值,i的取值为1～4。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器

人口腔角质形成细胞系（human oral keratino⁃cyte，HOK）由陈谦明教授惠赠

。

ATCC

25845

（ATCC，美国），OKM 培养基（Sciencell，美国），PBS（上海生工，中国），dispase酶（Sigma，美国），DMEM 培养基（Hyclone，美国），胎牛血清（WISENT，美国），RNAiso Plus（TaKaRa，中国），无水乙醇（上海生工，中国），氯仿（国药，中国），异丙醇（国药，中国），PrimeScript

RT reagent⁃Kit Perfect Real Time（TaKaRa，中国），TB Green Pre⁃mix Ex Taq（TaKaRa，中国），BCA protein assay kit（Solarbio，中国），MYO1B 一抗（Santa Cruz，美国），β⁃Tubulin 一抗（Proteintech Biotechnology，中国），辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（碧云天，中国），超敏ECL 化学发光试剂盒（碧云天，中国），实时荧光定量PCR 仪（Thermo Fisher，美国），小型高速离心机（Eppendorf，美国），Bio⁃Rad 电泳系统（Bio⁃Rad，美国），多功能酶标仪（Bio⁃Tek，美国）。

1.2 样本的收集与处理

1.2.1 pHOKs 的分离与培养 本实验获得同济大学附属口腔医院伦理委员会的批准（伦理审批号：2018⁃002）。组织来源于同济大学附属口腔医院口腔颌面外科智齿拔除术时取下的颊黏膜组织，把组织放到含10%双抗PBS 中清洗三遍。随后将组织放到0.25%中性蛋白酶（dispaseⅡ）中4 ℃过夜。第二天用无菌眼科镊分离组织上皮，PBS 清洗2 次，0.25%含EDTA 的胰酶37 ℃震荡消化4 min，用含10%FBS 的DMEM 培养基终止消化，离心，去上清，PBS 清洗沉淀2 次，用2 mL OKM 培养基重悬沉淀并铺板于六孔板，培养于37 ℃、5%体积分数CO

的细胞培养箱中。

你说天底下竟有这么好玩的东西，无须自个儿露面（王爷小时候虽淘气，人前却是那样的羞涩），只幕后把那些个花花绿绿的木偶肘在手上，张飞李逵关云长，想怎样就怎样，稀里哗啦猛打一气，实在是太合小时候王爷那颗心了，恨不能直接跟着那戏班子就上台去。

1.2.2 HOK 细胞培养 HOK 细胞以5×10

个/mL 的细胞密度接种于12 孔板中，在添加了10%FBS 的DMEM 培养基中，37 ℃、5%体积分数CO

的细胞培养箱中培养，待镜下细胞密度达90%时用于实验。

1.2.3

.

菌株培养与菌液制备 冻存于-80 ℃的

.

菌液于37 ℃化冻，均匀涂于基础厌氧血平板，加厌氧袋置于密封袋，置于37 ℃孵箱复苏；3 d 后挑取平板上黑褐色菌点于新鲜液体厌氧培养基中，盖上并旋松管盖，加厌氧袋置于密封袋中，置于37 ℃摇床。1 d 后测菌液OD

=1，以4 000 rpm离心3 min，弃上清，PBS 清洗3 次后，加1 mL PBS重悬菌液，最终菌液浓度为1×10

CFU/mL。

②菌液与HOK 细胞系共同培养：HOK 细胞吸去细胞上清液，PBS 轻柔洗涤细胞3 次，更换为不含FBS 的DMEM 培养基。

1.2.4 菌液与细胞共同培养 ①菌液与pHOKs 共同培养：pHOKs 培养到第三代后用于实验，吸去细胞上清液，PBS 轻柔洗涤细胞3 次，更换为不含血清的DMEM 培养基，每孔加入10 μL 菌液，分别共培养4 h 和24 h 作为两实验组，以未与菌液共培养的pHOKs 作为对照组，处理后的细胞于37 ℃、5%体积分数CO

的细胞培养箱中分别培养相应时长，随后提取细胞总RNA 用于转录组测序。

③对照组与共培养24 h 组之间得到的上调DEGs 富集于12 条KEGG 通路中，显示其与白介素⁃17（interleukin⁃17，IL⁃17）信号通路、TNF 信号通路、金黄色葡萄球菌感染（

infec⁃tion）等相关（图4b）。

1.3 CCK⁃8 法检测细胞活性

通过CCK⁃8 法检测

.

刺激后HOK 细胞的活性。HOK 细胞与

.

共培养。共培养完成后，轻柔吸去细胞上清液，PBS 轻柔洗涤细胞3 次，每孔加入100 μL DMEM 培养基和10 μL CCK⁃8 溶液，避光反应1 h。随后在酶标仪450 nm 处测定细胞上清液吸光度，相对细胞活力计算方法：（实验组细胞吸光度/对照组细胞吸光度）×100%。

在清华,校长可以享有公车,但他宁愿步行；校长出差按规定可以乘坐飞机,但他却宁愿搭乘邮车,其目的无非是要为公家省些钱。抗战时期,清华、北大、南开三校合并成立“西南联大”迁往内地。云南省主席龙云的女儿龙国碧想进清华附中读书,结果却未能如愿。龙云心里不爽,因为他对战时的“西南联大”多有资助。但后来当他打听到梅贻琦的女儿梅祖芬也未被录取时,他不但怨气全消,还深怀敬意。有这样的人去管理学校,还有什么不放心的呢。

1.4 总RNA 的提取

将样本送至上海晶能生物科技有限公司完成转录组测序。基本程序为：RNA 片段化，逆转录成双链DNA，加工双链DNA 末端，PCR 扩增。PCR 产物热变性形成单链，单链DNA 环化得到单链环状DNA 文库，DNA 文库用Illumina Nova 6000 测序平台进行高通量转录组测序，获得高质量的转录组数据。

1.5 转录组测序

将共培养完成后的细胞吸去上清，PBS 轻柔洗涤3 次，按试剂盒说明提取总RNA。测定RNA浓度。

1.6 测序结果的分析

对数据质量评估，对所获得的序列进行基因注释，用HTSeq 软件计算各个基因的reads count。使用R 语言limma 包进行DEGs 挑选。取log2（差异倍数）≥1 且

≤0.05 的基因筛选为具有统计学意义的DEGs。通过R 软件的Pheatmap 包对DEGs 进行聚类分析，用GO 数据库对DEGs 进行生物学功能注释，用KEGG Pathway 数据库对DEGs 进行通路的注释。利用R 语言富集常用包clusterProfiler（版本3.18.0）对DEGs 做GO、KEGG pathway 的注释富集分析。对DEGs 数量≥2，且统计

≤0.05 的注释条目认为具有统计学意义。

1.7 qRT⁃PCR 验证差异表达基因

监测数据还显示，9月WTI原油均价为69.35美元/桶，环比上涨1.0%，同比涨幅42.6%；布伦特原油均价77.23美元/桶，环比上涨6.8%，同比涨幅41.9%；迪拜原油均价75.86美元/桶，环比上涨5.5%，同比涨幅45.5%；胜利原油均价67.96美元/桶，环比上涨5.0%，同比涨幅39.4%。上述四地原油9月平均价格为72.60美元/桶，环比上涨4.6%，同比涨幅42.4%。

1.8 Western Blot 验证差异表达基因

使用含1 mmol/L PMSF 的RIPA 裂解液提取HOK 细胞总蛋白，BCA 试剂盒测蛋白浓度。7.5%的SDS⁃PAGE 凝胶电泳分离，转移至PVDF 膜，封闭液室温下封闭1 h，一抗孵育，4 ℃过夜，洗膜后加二抗，室温孵育1 h，增强型化学法显色，Im⁃ageQuant LAS 4000 mini 显影。

1.9 统计学分析

应用GraphPadPrism 8.0 对数据进行统计学分析并绘制统计图。多组数据间比较采用单因素方差分析（one⁃way analysis of variance，ANOVA），以Tukey 进行两两比较，

＜0.05 为差异有统计学意义。

1.2.4 疾病相关基因的高通量测序分析 将提取的患儿外周血全基因组DNA送至北京德易东方转化医学研究中心进行与脑发育异常相关的所有已知基因全外显子及相应剪切位点的高通量测序分析。

2 结 果

2.1 P.m 对HOK 细胞活力的影响

在倒置相差显微镜下可观察到完整的HOK 单层细胞（图1a），HOK 细胞与

.

共培养后，细胞密度降低，对培养皿底的黏附能力降低；部分细胞形态发生变化，由原本大而扁平的多角形形态转变为扁圆形或圆形，部分细胞的细胞核发生了核固缩，显示出空泡变性和细胞裂解，细胞边界不清晰（图1b，10 μL 菌液与HOK 细胞共培养8 h 后镜下图）。

对共培养后HOK 细胞的细胞活力检测结果（图1c、1d）表明，

.

会降低HOK 细胞活力，在时间梯度组中，共培养4 h后细胞活力降低到68.38%±12.30%（

＜0.001），共培养6 h 后细胞活力降低至38.97% ± 1.05%（

＜0.001），共培养8 h 后细胞活力降低至27.44% ± 0.30%（

＜0.001）；在浓度梯度组 中10 μL 组 细 胞 活 力 下 降 至60.33% ± 3.93%（

＜0.001），20 μL 组细胞活力下降至44.9% ±2.77%（

＜0.001），30 μL 组 细 胞 活 力 下 降 至29.02%±2.46%（

＜0.001）。

②加强示范区建设。借鉴欧盟经验，对一些重大技术难题，如降雨——径流分析、临界预警指标的确定方法、预警信息发布等，宜选择具有不同自然地理特征的小流域，建立山洪灾害防治小流域示范区，开展专项研究，并作为一项长期任务持续开展下去。通过不断探索，提出上述重大技术难题的解决方案，完善后向全国推广。

2.2 P.m 共培养后pHOK 细胞差异表达基因及聚类分析

聚类分析结果显示，对照组与实验组的基因簇明显分开，提示对照组和实验组间在整体基因表达上存在明显差异（图2a）。在本次测序所获取的全部基因中，pHOK 与

.

共培养4 h 组与对照组间有1 788 个基因的表达存在统计学差异，共培养24 h 组与对照组间有1 832 个基因的表达存在统计学差异。

无偿献血采血护理质量关系到采血质量以及献血者的健康安全,需要引起足够的重视,对于干扰和妨碍采供血的风险因素,应采取有效的护理干预和风险控措施,进而提高采供血质量,为临床医疗应用提供支持。因此,在无偿献血采血护理工作当中,应着重加强风险评估和控制。深入到采血过程的各个步骤、环节进行风险评估,从中发现安全隐患[2]。

②对照组与共培养4 h 组之间得到的下调DEGs 富集于19 个生物过程条目中，如上皮发育（epidemis development）、皮 肤 发 育（skin develop⁃ment）、上皮细胞分化调节（regulation of epithelial cell differentiation）等；富集于1 个细胞成份条目中，即角质化包膜（cornified envelope）（图3b）。

2.3 P.m 共培养后pHOK 细胞差异表达基因GO 富集分析

对各组上调的DEGs 和下调的DEGs 进行GO富集分析结果显示：①对照组与共培养4 h 组之间得到的上调DEGs 富集于604 个生物过程（biologi⁃cal process，BP）条目中，如细胞对脂多糖的反应（cellular response to lipopolysaccharide）、对细菌来源分子的反应（response to molecule of bacterial ori⁃gin）、生物刺激的细胞反应（cellular response to biot⁃ic stimulus）等；富集于12 个细胞成分（cellular com⁃ponent，CC）条目中，如细胞顶端部分（apical part of cell）、收缩纤维（contractile fiber）、肌节（sarcomere）等；富集于18 个分子功能（molecular function，MF）条目中，如细胞因子活性（cytokine activity）、受体配体活性（receptor ligand activity）、信号受体激活因子活性（signaling receptor activator activity）等（图3a）。

逆转录试剂盒逆转录合成cDNA，再以实时荧光定量试剂盒进行实时荧光定量PCR。以GAPDH为内参。肌球蛋白1B（myosin1B，MYO1B）正义链：5’⁃GGAGACCATGGCCA AAATGG⁃3’，MYO1B 反义链：5’⁃GGTCAAAGCGCT TCTTGAGG⁃3’；GAPDH正义链：5’⁃GGACCTGACC TGCCGTCTAG⁃3’，GAP⁃DH 反义链：5’⁃GTAGCCCA GGATGCCCTTGA⁃3’。

pHOK 与

.

共培养4 h 组相较对照组中表达上调基因为877 个，表达下调基因为916 个；共培养24 h 组相较对照组中表达上调基因为1 012 个，表达下调基因为828 个，两处理组与对照组间有1 090 个共同差异表达基因（common differentially expressed genes，cDEGs）（图2b～2d，表1）。

③对照组与共培养24 h 组之间得到的上调DEGs 富集的GO 通路与4 h 组在分子功能富集条目相似度高（图3c）。

④对照组与共培养24 h 组之间得到的下调DEGs 富集于84 个生物过程条目中，如化学突触传递的调节（modulation of chemical synaptic transmis⁃sion）、跨突触信号的调节（regulation of trans⁃synap⁃tic signaling）、神经递质转运（neurotransmitter trans⁃port）等；富集于21 个细胞成份条目中，如内质网腔（endoplasmic reticulum lumen）、神经元与神经元突触（neuron to neuron synapse）、突触后密集区（post⁃synaptic density）等；在MF 条目中没有具有统计学差异的富集（图3d）。

2.4 P.m 共培养后pHOK 细胞差异表达基因KEGG通路富集分析

①对照组与共培养4 h 组之间得到的上调DEGs 富集于33 条KEGG 通路中，显示其与细胞因子与细胞因子受体相互作用（cytokine⁃cytokine re⁃ceptor interaction）、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体相互作用（viral protein interaction with cyto⁃kine and cytokine receptor）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路等相关（图4a）。

②对照组与共培养4 h 组之间得到的下调DEGs 在KEGG 通路数据库中没有得到具有统计学差异的富集条目。

7 投稿方式 投稿请发电子邮件(邮件主题写第一作者姓名和文题)，本刊E-mail：zacaoxuebao@163.com或zckx@jaas.ac.cn。审稿时间一般为20天左右，特别优秀的稿件可加快处理。录用通知将通过电子邮件通知作者，投稿后请注意查看E-mail。

为分别探究

.

对HOK 细胞系在时间梯度和浓度梯度共培养后造成的影响，设置时间梯度共培养组和浓度梯度共培养组，以未与菌液共培养的HOK 细胞作为对照组。时间梯度组每孔加入10 μL 菌液，各组共培养体系最终菌液浓度为5 ×10

CFU/mL，分别培养4 h、6 h、8 h；浓度梯度组每孔分别加入10 μL、20 μL、30 μL 菌液，各实验组体系中最终菌液浓度分别为：5×10

CFU/mL、10×10

CFU/mL、15×10

CFU/mL，共 培 养4 h。 用DMEM 培养基补足液体量，对照组只添加基础DMEM 培养基，使各组共培养体系最终液体的量相同，总体积2 mL，以便计算菌液浓度。将处理后的细胞在37 ℃、5%CO

的细胞培养箱中培养，随后吸去上清，PBS 轻柔洗细胞3 次，待后续实验。

④对照组与共培养24 h 组之间得到的下调DEGs 在KEGG 通路数据库中没有得到具有统计学差异的富集条目。

2007年，医院将建于1892年的巴洛克式建筑旧址改造为医院历史纪念馆，成为医院文化的汇聚地，后被定为省市爱国主义教育基地、对外文化交流基地。

2.5 差异表达基因肌球蛋白1B 的验证

在本次转录组测序结果中，MYO1B 是共培养4 h 组、共培养24 h 组共有的DEG。

将相同浓度（5×10

CFU/mL）的

.

与HOK 细胞共培养不同时长（0、4 h、6 h、8 h），MYO1B 的mRNA 表达和蛋白表达在4、6、8 h 均显著增加，差异有统计学意义（

＜0.005）。

将不同浓度的

.

（10 μL 组、20 μL 组、30 μL组最终菌液浓度分别为：5×10

CFU/mL、10×10

CFU/mL、15×10

CFU/mL）刺激HOK 细胞4 h 后MYO1B 的表达均显著增加，差异有统计学意义（

＜0.005）（图5）。

3 讨 论

细菌微生物的菌群失调可能是OLP 发生发展的原因之一。本课题组前期发现

.

在OLP 患者颊黏膜表面构成比增加最为显著，而口腔上皮角质形成细胞作为口腔黏膜抵御外界入侵的第一道防线，可能直接受

.

刺激影响。在与

.

共培养后，HOK 细胞在镜下可保持完整的细胞形态并形成完整的单层细胞，

.

的刺激会降低HOK 细胞的活力，对HOK 细胞造成损伤；在对OLP 患者的口腔角质形成细胞进行体外分离培养后，发现较正常人群相比，OLP 患者的口腔角质形成细胞的细胞活力明显降低，细胞形态也发生明显变化

，本课题组建立的

.

⁃HOK 细胞共培养模型与之相似，推测

.

损伤HOK 细胞可能与OLP 临床中发生上皮层糜烂和溃疡有关。

玉米膜下滴灌高产栽培技术是覆盖、灌溉、高产技术相结合的综合技术。为了合理实施该技术，需要在种植初期进行一系列的前期准备工作，在正式实施中，中后期滴灌管网的布设和田间管理尤为重要，加强灌区灌溉管理。积极开展化肥和施肥管理，从多个方面进行病虫害防治，提高玉米产量。

目前认为免疫失调在OLP 发病过程中起到重要作用

，多个学者报道的OLP 组织高通量测序结 果

显 示 其 多 富 集 在 与 免 疫 相 关 的GO 与KEGG 通路如趋化因子活跃、细胞因子活跃和原发性免疫缺陷等免疫炎症相关通路，以及与上皮发育分化、神经受体配体作用和代谢相关的通路如表皮分化复合体

、激活神经元的受体配体交互和酪氨酸代谢

等。有文献报道OLP 组织中Toll样受体⁃4（toll like receptor⁃4，TLR⁃4）的明显高表达

，且存在多种细胞因子表达改变，如肿瘤坏死因 子α（tumor necrosis factor⁃α，TNF⁃α）表 达 升高

，白介素⁃23（interleukin⁃23，IL⁃23）和IL⁃17 过表达等

。为探究

.

对pHOK 短时间作用及较长时间作用的影响，并探究

.

刺激与OLP 发生发展之间的关联，本研究进一步将

.

与pHOK 共培养后4 h和24 h进行转录组测序，研究结果显示，

.

刺激pHOK 细胞后，炎症相关通路如IL⁃17 信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、Toll 样受体通路、细胞因子与细胞因子受体互作等在两处理组中均明显富集，其他KEGG 通路如上皮发育、跨突触信号调节等也有较明显富集，而这些通路与既往报道的OLP 转录组测序的富集通路有明显重合。

本 研 究 结 果 显 示，

.

与pHOK 共 培 养4 h 组GO 通路明显富集在细胞顶端部分（apical part of cell）和顶端质膜（apical plasma membrane）这两个细胞成分中。单个上皮细胞之间的空间密封由顶端连接复合物（apical junctional complex）执行，其包含紧密连接、黏附连接和桥粒

。细胞黏附建立后，紧密连接通过其蛋白质组分将空间密封起来

。本课题组推测，在

.

刺激pHOK 细胞早期，pHOK 细胞的细胞顶端部分和顶端质膜的顶端连接复合物成分合成加强，以增强细胞间紧密连接，抵抗外界细菌侵入。

本研究结果显示，MYO1B 是pHOK 与

.

共培养4 h、24 h 组均上调表达的差异基因。MYO1B 即肌球蛋白1B，肌球蛋白是一种以ATP 调节的方式结合到肌动蛋白的蛋白质，与肌动蛋白的结合促进肌球蛋白水解ATP，从而为肌动蛋白丝的运动提供动力

。肌动⁃肌球蛋白的收缩是细胞骨架改变的形式之一，肌动蛋白⁃肌球蛋白环也是组成细胞紧密连接的重要部分，肌动蛋白⁃肌球蛋白环在维持上皮极性和上皮屏障功能中发挥了重要作用

。Lv 等

报道，肌球蛋白ⅡA（myosin⁃ⅡA）调控缺氧低糖脑内皮细胞的紧密连接，抑制肌球蛋白ⅡA 可减弱claudin⁃5 和ZO⁃1 等紧密连接蛋白的形态变化；Omelchenko 等

报道，在整体迁移的细胞中，肌球蛋白ⅨA（myosin⁃ⅨA）的敲除导致肌动蛋白细胞骨架的改变，细胞⁃细胞间黏附被破坏，导致细胞分散。以上这些实验表明，肌球蛋白家族通过细胞骨架与紧密连接调节了上皮细胞屏障。本研究结果显示，

.

浓度梯度对MYO1B 表达的影响更为明显，提示菌群数量的失衡对紧密连接有较大影响。这与本课题组前期研究发现在OLP患者颊黏膜表面菌群失调相印证。此外，文献报道MYO1B 参与了舌部鳞状细胞癌等多种肿瘤的发展与转移，且预示了较差的预后以及隐匿性淋巴结转移

。提示MYO1B 可能参与了OLP 恶变。

综上，本研究对与

.

共培养4 h 和24 h 的pHOK 细胞进行转录组测序，研究发现

.

和pHOK 共培养过程中IL⁃17 信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、Toll 样受体通路等KEGG 通路明显富集，对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、细胞顶端部分等GO 通路明显富集，提示

.

对口腔角质细胞的转录组存在重要影响，其中MYO1B 可能在细菌⁃细胞相互作用中发挥了重要作用。本研究为进一步揭示OLP 的发病机制提供了相关的研究基础。

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