基于MALDI-TOF MS鉴别产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌的应用研究

岑坷 斯怡莎 裘春宁 徐丽慧 陈琼 吴旻 吴盛海

肠杆菌目细菌是引起医院感染与社区感染的主要病原微生物[1-2]，其中大肠埃希菌是导致尿路感染和血流感染的常见病原菌。随着广谱抗生素的滥用，产超广谱 β-内酰胺酶（extended spectrum β-lactamases,ESBLs）肠杆菌目细菌逐渐增多，使得临床能够选用的抗生素越来越有限，给临床治疗带来一定难度[3-5]。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS）是一种可靠的细菌和真菌鉴定方法[6-7]，具有准确、廉价、高通量和周转时间短等特点，并可用于细菌耐药性分析与分型，如区分肺炎链球菌几种常见血清型[8]，快速鉴别甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌与耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌[9]。笔者采用仪器法检测细菌耐药表型，再对产ESBLs菌株扩增16S rRNA目的片段并进一步测序区分其基因型别，同时采用MALDI-TOF MS收集质谱峰图，通过建模和验证，探讨MALDI-TOF MS在肠杆菌目产ESBLs菌株基因型别鉴定中的价值，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 收集2019年1至12月浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院各类无污染体液标本（脓液、血液、胆汁、穿刺液、胸腹水等）中分离培养的肠杆菌目菌株共368株，置20%甘油肉汤中，-80℃冰箱冷冻保存备用。

1.2 仪器和试剂 VITEKⅡ Compact及其配套的

GN-AST药敏卡（批号：1130774103）、MH 平板（批号：1007209400）、哥伦比亚血琼脂平板（批号：1006923520）（法国生物梅里埃公司）；抗生素纸片亚胺培南（10 μg）和美罗培南（10 μg）（美国 OXOID 公司）；MALDI-TOF MS质谱仪及其配套的质谱样品处理基质溶液（α-氰基-4羟基肉桂酸）与分析软件（德国布鲁克公司）。PCR扩增仪C1000型、凝胶成像仪Gel Doc XR型、电泳仪及水平电泳系统（美国伯乐公司）。恒温金属浴K10CD型（上海京工实业有限公司）。高速冷冻离心机（美国赛默飞有限公司），PCR反应试剂（2×M5 Taq PCR mix），Gel Red核酸染料及PCR反应试剂（北京聚合美生物技术有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 细菌复苏 取出保存的菌种，接种至MH培养基，置35℃空气培养箱培养18～24 h。

1.3.2 菌种鉴定 采用MALDI-TOF MS对前1天复苏的单菌落进行鉴定，用灭菌牙签取少量菌落，加入1 μl质谱样品处理基质液（α-氰基-4羟基肉桂酸）覆盖样品，待靶板室温干燥后放入质谱仪中，使用Biotyper 3.0软件进行鉴定分析。

1.3.3 产ESBLs及碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE）筛选 制备0.5麦氏单位菌悬液，并通过VITEKⅡ Compact及其配套的GN-AST药敏卡进行常规药敏试验。筛选出产ESBLs菌株以及亚胺培南非敏感菌株。对亚胺培南非敏感菌株，制备0.5麦氏单位菌悬液均匀涂布MH平板，15 min之内贴亚胺培南纸片与美罗培南纸片，置35℃培养箱空气环境中培养16～18 h。根据美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）M100-S29判读抑菌圈直径，亚胺培南或美罗培南抑菌圈直径≤19 mm的菌株即CRE菌株（≥23 mm为敏感，≤19 mm为耐药）。采用大肠杆菌ATCC 25922和铜绿假单胞菌ATCC 27853对VITEKⅡCompact仪器进行质量控制。

1.3.4 DNA模板提取 取1.5 ml无菌EP管，加入100 μl ddH2O。用灭菌枪头挑取筛选出的产ESBLs菌株及CRE菌株，加入含有100 μl ddH2O的EP管中，轻轻吹打混匀至约1.0单位麦氏浊度，放入100℃的恒温金属浴中裂解10 min后12 000 r/min离心5 min，上清液置-20℃冰箱冷冻保存备用。

1.3.5 PCR引物设计、合成与扩增 各类产ESBLs基因型（CTX-M-1、CTX-M-9、TEM、SHV）引物由上海铂尚生物技术有限公司合成，见表1。反应体系：25 μl体系（2×M5 Taq PCR mix 12.5 μl，上游引物 0.5 μl，下游引物 0.5 μl，ddH2O 10.5 μl，DNA 模板 1 μl）；PCR 反应条件：95℃预变性 5 min，95℃变性 30 s、55℃退火 30 s、72℃延伸30 s循环30次，72℃延伸10 min后4℃保持。不同引物的熔解温度（melting temperature,Tm）不同，退火温度根据Tm值及实验结果做出相应调整，以达到最佳效果。其中CTX-M-1、TEM退火温度采用57℃，CTX-M-9退火温度采用58℃，SHV退火温度采用55℃。

表1 ESBLs目的基因扩增引物序列

1.3.6 PCR产物测序 将PCR扩增产物置于含GelRed核酸染料的1%琼脂糖凝胶上进行电泳，并于凝胶成像系统下观察。将确认的PCR扩增阳性产物送至铂尚生物技术有限公司进行测序。测序结果于国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）官网上采用BLAST软件比对，以确定其ESBLs基因型。

1.4 指纹图谱采集

1.4.1 菌种准备 取上述大肠埃希菌菌株，传代置于MH培养基，35℃空气环境中孵育16～18 h。

1.4.2 菌株处理 取1.5 ml无菌EP管，在室温下加入300 μl ddH2O后挑取适量菌落混匀，得到约为2.0麦氏浊度的菌悬液。加入900μl无水乙醇，混匀后12000r/min离心2 min，弃上清液，再次重复上述步骤后将沉淀物室温放置30 min，保证乙醇彻底挥发。加入50 μl 70%甲酸，混匀后震荡1 min，之后加入等量乙腈，混匀。12 000 r/min离心2 min后吸取1 μl上清液于配套靶板中，待干燥后加入1 μl配套基质液。

1.4.3 校准定标 取标准校准品BTS，1 μl点样于上述靶板最后4孔，在Flex control界面下的calibration中选取BTS样本点-start-add至240，峰强度足够高后在automatic assign下点击apply，保证5个以上峰的error在±300内，保存。

1.4.4 峰图采集与鉴定 质谱仪线性正性模式用最大频率（20～200 Hz）采集相对分子质量2 000～20 000蛋白图谱，通过Biotyper 3.0分析，保证分值在2.000以上。

1.5 数据分析 采用 ClinProTools 3.0软件对各质谱峰图进行分组分析。具体步骤参照软件自带的 Clin－ProTools 3.0 Manual进行操作。维持各参数不变的情况下，将ESBLs阴性、阳性两组以及ESBLs阴性与各基因型分别比较，调入样品数据后分别选择遗传算法（genetic algorithm,GA）、监督式神经网络算法（spiking neural network,SNN）、快速分类算法（quick classification algorithm,QC）对数据进行分析并建立相应的模型，判断该模型的灵敏度和特异度；同时对特征峰进行ROC曲线分析。

1.6 模型建立与验证 对灵敏度和特异度均高于90%的两组菌株中，随机各抽取20株菌株，采用上述3种算法中灵敏度及特异度最高的算法建立分组模型，并用余下的所有菌株对该模型的鉴定能力进行验证，以判断该模型是否可以将两组菌株区分开来。

2 结果

2.1 菌株分布及产ESBLs菌株统计 肠杆菌目非重复株368株中大肠埃希菌255株（69.3%），肺炎克雷伯菌53株（14.4%），阴沟肠杆菌27株（7.3%），其他肠杆菌目细菌33株（9.0%）。368株中产ESBLs菌株169株（45.9%），CRE菌株 33株（9.0%）。169株产 ESBLs菌株中，大肠埃希菌152株（89.9%），肺炎克雷伯菌8株（4.7%），其他肠杆菌目细菌9株（5.4%）。

2.2 产ESBLs菌株基因型分布 在169株产ESBLs菌株中CTX-M型共130株，其中CTX-M-1型80株，以CTX-M-55亚型（39株，占30.0%）和CTX-M-15亚型（34株，占26.2%）为主；CTX-M-9型64株，主要为CTX-M-14亚型（38株，占 29.2%）；SHV 型 3株，TEM型3株；同时检测到两种基因型21株，未检测到以上4组基因36株。在33株CRE菌株中，CTX-M-9型16株，其中CTX-M-65亚型14株，CTX-M-14亚型2株；CTX-M-1型5株；SHV型6株；同时检测到两种基因型3株，未检测到以上4组基因9株。见表2。

表2 产ESBLs菌株及CRE菌株的ESBLs基因型分布（株）

2.3 ClinProTools软件分析结果

2.3.1 各组算法统计 各组经过ClinProTools统计后发现产ESBLs大肠埃希菌与阴性株存在重叠，无法明显区分。CTX-M-1型大肠埃希菌与阴性株也存在明显重叠，无法明显区分。而CTX-M-9型大肠埃希菌与阴性株较清晰地坐落在两个非重叠区域。见图1a、b、c（插页）。

图1 不同类型产ESBLs阳性株与阴性株二维分型图[a：产ESBLs大肠埃希菌阳性株与阴性株根据特征质谱峰10 394 Da和64 150 Da二维分型图，其中红色为产ESBLs大肠埃希菌阳性株，绿色为阴性株；b：产ESBLs大肠埃希菌阳性株（CTX-M-1型）与阴性株根据特征质谱峰4 451 Da和12 980 Da二维分型图，其中红色为产ESBLs大肠埃希菌阳性株（CTX-M-1型），绿色为阴性株；c：产ESBLs大肠埃希菌阳性株（CTX-M-9型）与阴性株根据特征质谱峰13 664 Da和6 415 Da二维分型图，其中红色为产ESBLs大肠埃希菌阳性株（CTX-M-9型），绿色为阴性株；d：产ESBLs大肠埃希菌阳性株（CTX-M-9型）与阴性株在荷质比为6 415 m/z处的对比图，其中CTX-M-9型含有特征性质谱峰6 415 m/z]

分别使用GA、SNN、QC 3种算法对3组数据进行分析：3种算法产ESBLs大肠埃希菌与阴性株的灵敏度和特异度均＜0.900；3种算法CTX-M-1型大肠埃希菌与阴性株的灵敏度和特异度也均＜0.900；而CTX-M-9型大肠埃希菌与阴性株通过3种算法进行计算后，GA 算法的灵敏度（0.980）和特异度（1.000）最好，其次是SNN算法（灵敏度为0.964，特异度为0.995），QC算法灵敏度和特异度最低（灵敏度为0.920，特异度为0.954）。

2.3.2 特征性峰数据统计 通过ClinProTools计算后显示，CTX-M-9型大肠埃希菌与阴性株在蛋白峰荷质比为6 415 m/z和13 664 m/z处具有特征性表现。结果显示，两组峰的PWKW值均＜0.000 001，说明两组数据的峰图鉴别具有统计学意义，见表3。ROC曲线显示两组蛋白峰图的AUC均＞95%，提示这两组峰在鉴别CTX-M-9型大肠埃希菌与阴性株上具有较高准确性。同时，利用ClinProTools寻找到这两组蛋白峰，将其放大后比较，发现CTX-M-9型的6 415 m/z和13 664 m/z蛋白峰明显高于阴性株。见图1d（插页）。

表3 CTX-M-9型与ESBLs阴性株在荷质比为13 664 m/z与6 415 m/z处的数据统计

2.3.3 数据验证 结果显示，蛋白峰仍在荷质比为6 415 m/z和13 664 m/z具有特征性表现，3种算法的灵敏度均为1.000，特异度均＞0.950。用余下阴性株和CTX-M-9型（包括同时携带CTX-M-9型与其他基因型）进行数据验证，发现采用GA算法后CTX-M-9型的鉴定率为81.9%（18/22），对阴性株的鉴定率为94.9%（56/59），对非CTX-M-9型大肠埃希菌的鉴定率只有63.0%。

3 讨论

ESBLs是一类主要存在于肠杆菌目细菌中，能够水解除头霉素和碳青霉烯类抗生素以外的几乎所有β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺酶。β-内酰胺酶抑制剂（如克拉维酸）能够抑制这种水解能力，从而恢复β-内酰胺类抗生素对产ESBLs菌株的敏感性[10]。CRE是一种能够对至少一种碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌目细菌。这类细菌能对包括β-内酰胺酶/酶抑制剂在内的所有β-内酰胺类抗生素耐药[11]。因此，笔者通过 VITEK CompactⅡ GN16中的 ESBLs确证试验（头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸、头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸、头孢吡肟和头孢吡肟/克拉维酸）来筛选产ESBLs菌株时，会因为CRE的存在使得ESBLs检测出现假阴性。

本研究收集的368株菌株中，以大肠埃希菌的数量最多，肺炎克雷伯菌其次，这与CHINET无菌体液中肠杆菌目细菌的分布情况一致[12]。其中产ESBLs菌株与CRE的阳性率分别为45.9%和9.0%；在产ESBLs菌株与CRE菌株中，分别以大肠埃希菌（59.6%，152/255）和肺炎克雷伯菌（39.6%，21/53）最高；均高于2012年CHINET无菌体液的检出率[11]；而在欧洲大多数发达国家，产ESBLs菌株的检出率均在30%以内[13]。出现这种情况的原因可能与抗菌药物的不规范使用，导致耐药菌株不断被筛选和诱导出来有关[14]。

通过基因分型显示，产ESBLs大肠埃希菌的基因型均为CTX-M型（CTX-M-1与CTX-M-9），通过Clin－ProTools统计后发现，指纹图谱分型对于CTX-M-1基因型表现出较差的效果，无法将CTX-M-1型与阴性株区分，而CTX-M-9型在蛋白荷质比为6 415 m/z和13 664 m/z处具有特征性表现。在3种不同算法中，GA算法具有最高的灵敏度（0.980）和特异度（1.000）。同时这两组峰的PWKW值均＜0.000 001，说明这两组蛋白峰在区分CTX-M-9型与阴性株上差异有统计学意义。同时这两组蛋白峰ROC曲线的AUC均＞95%，提示这两组蛋白峰在鉴别CTX-M-9型大肠埃希菌与阴性株上具有较高准确性。经过外部验证后CTX-M-9型的鉴定率为81.8%，对阴性组的鉴定率为94.9%，进一步说明了这两个峰对于CTX-M-9型大肠埃希菌的鉴别能力。但该模型对于非CTX-M-9型大肠埃希菌的鉴定率只有63.0%，效果并不理想。

本研究中产ESBLs菌株主要为CTX-M型，其中主要以CTX-M-1型的CTX-M-55亚型（30.0%，39/130）和 CTX-M-9型的 CTX-M-14亚型（29.2%，38/130）为主。其次为CTX-M-1型的CTX-M-15亚型（26.2%，34/130），这与蒋伟等[15]报道一致。相关研究表明，在大肠埃希菌中CTX-M-9型的CTX-M-14亚型是我国最为流行的基因型。在菌血症患者中CTX-M-9型的CTX-M-14亚型大肠埃希菌毒力基因pap分布较CTX-M-1型更为广泛。在尿路感染中CTX-M-9型的CTX-M-14亚型大肠埃希菌较CTX-M-1型具有更广泛的fedC毒力岛[16]，因此在菌血症和尿路感染中CTX-M-9型大肠埃希菌更容易携带高毒力基因。

Schaumann等[17]对利用MALDI-TOF MS区分肠杆菌目细菌β-内酰胺酶研究中表明，产ESBLs大肠埃希菌不形成单独的特征性蛋白簇，而是分散在产ESBLs阴性株中，无法进行可靠的区分，这与本研究一致。但Schaumann等[17]并未细致研究各基因型的指纹图谱分型。而Correa-Martínez等[18]通过基于MALDITOF MS的直接靶向微滴生长测定（DOT-MGA）可以准确区分ESBLs，但因测定需要加入抗生素靶板孵育，试验比较繁琐与复杂。而本研究中，笔者采用Clin－ProTools软件建立的模型可以较准确的分型CTX-M-9型，对临床快速用药具有一定指导意义。

本研究仍存在不足之处。MALDI-TOF MS对细菌的低区分能力可能与孵育时间与培养条件有关,这些因素可能会影响质谱峰图的质量[19]。因此提取方法需要限定在同一条件下经同一人员操作；同时该模型对于非CTX-M-9型的鉴定率只有63.0%，说明该模型的分型能力有限。

综上所述，在相同实验环境及操作下，通过MALDI-TOF MS可以快速区分出ESBLs阴性株与CTXM-9型菌株，但无法准确区分所有的CTX-M型菌株，因此需要通过联合其他方法判断来准确、快速分型产ESBLs菌株的基因型。