基于网络药理学的松花粉调节高脂血症机制探讨△

余泽宇，梁士兵，高凯，石丽花，张红，刘建平*

1.北京中医药大学 循证医学中心，北京 100029；2.北京中医药大学 国际循证中医药研究院，北京 100029；3.北京中医药大学 中医学院，北京 100029；4.烟台新时代健康产业有限公司，山东 烟台 264006；5.新时代健康产业（集团）有限公司，北京 102206

高脂血症（hyperlipidemia）是一种脂质代谢紊乱性疾病，指人体内脂肪代谢或者运转异常，使血液中血脂含量超出正常水平，血中胆固醇、三酰甘油过高或高密度脂蛋白过低。高脂血症是导致心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的重要诱因，而CVD 是成年人死亡的主要原因之一。有研究表明，血脂异常可导致机体发生慢性炎症反应，而炎症因子的释放可通过损害血管内皮细胞及血管壁，增加动脉粥样硬化的发病风险[1]；也有研究指出，与总胆固醇水平正常的人相比，高脂血症患者发生CVD的风险大约是其2倍[2]。目前，临床上使用的调脂药物主要有他汀类、贝特类等，虽然疗效显著，但是近年来研究发现他汀类药物可能引发肝损伤、横纹肌溶解、新发肿瘤和糖尿病等不良反应[3]。因此，寻找治疗高脂血症的其他有效药物十分必要。

松花粉，又名松花、松黄，为淡黄色粉末，主要来源于松科植物马尾松Pinus massonianaLamb.、油松P.tabulieformisCarr.或同属数种植物的干燥花粉[4]。其始载于《神农本草经》，被列为上品，在后期的《新修本草》《本草纲目》《本草从新》等中医传统著作中均有记载[5]。有研究显示，松花粉对高脂血症具有一定防治效果[6-8]。然而，松花粉作为一种中药，存在成分复杂、多作用靶点、多作用通路的特点，采用传统药理研究方法难以系统、完整地阐明其作用机制。网络药理学是系统生物学的重要组成部分，其整体性、系统性和注重药物间相互作用的特点与中医药学的基本特点相吻合，可用来分析药物在网络中与特定节点的相互作用关系，是一门从系统层面揭示中药对机体调控网络作用的新兴学科，为研究传统中药的现代药理学作用机制提供了新的思路[9-10]。

本研究通过对文献及多种公共数据平台进行检索，并借助网络药理学分析方法，初步揭示松花粉治疗高脂血症的潜在作用机制，为松花粉的进一步研究和临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 松花粉靶点确定及筛选

以“松花粉”“化学成分”“靶点”为检索词，检索并筛选中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https://tcmsp-e.com）[11]、中国知网（https://www.cnki.net）、PubMed 数据库（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov）中松花粉化学成分相关的数据和文献，对其化学成分进行整理归纳，检索日期截至2021 年6 月29 日。利用PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）[12]获得化学成分的标准名称和分子式，并导入SwissTargetPrediction 数据库（http://www.swisstargetprediction.ch）[13]，设定物种为“人类”，以分子相关靶点可能性（probability）≥0.08为界值进行靶点预测和筛选。

1.2 疾病相关靶点筛选

以“hypertriglyceridemia”“hypercholesterolemia”“hyperlipidemia”为检索词，检索GeneCards 数据库（https://www.genecards.org）[14]和OMIM 数据库（https://omim.org）中与高脂血症相关的潜在靶点，检索日期截至2021年6月30日。其中，对GeneCards数据库中的检索结果进行合并后，按照相关性得分（relevance score）由高到低排序并删除重复值，之后再以相关性得分≥1 为筛选原则对靶点进行筛选。将筛选得到的靶点与OMIM 数据库所得靶点进行合并，从而得到所有高脂血症相关靶点。

1.3 网络构建与分析

利用Venny 2.1软件将得到的松花粉相关靶点与疾病相关靶点取交集，并绘制韦恩图。进而提交至STRING 数据库（https://cn.string-db.org/）[15]构建智人的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络模型，其中最小相互作用阈值设定为“highest confidence”，其余设置均为默认。得到PPI 网络后，通过Cytoscape 3.8.2 软件绘制松花粉成分-交集靶点网络，并使用软件中的Centiscape 插件计算各节点的中介中心性（betweenness）和度（degree）值；通过MCODE 插件进一步分析PPI 网络，提取子网络，得到潜在功能模块。

1.4 富集分析

将松花粉-高脂血症交集靶点导入Metascape 平台（https://metascape.org/）[16]，设置P<0.01、最小通路相关基因数为3、富集因子>1.5，进行交集靶点的基因本体（GO）富集分析[17]以探索靶点可能涉及的分子功能、生物过程以及基因产物活跃位置；并进行京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析[18]，以探寻靶点参与的潜在通路。

2 结果

2.1 松花粉靶点确定及筛选

通过中国知网、PubMed数据库共检索得到松花粉化学成分相关文献29篇，其中5篇[19-23]提及松花粉化学成分、分子式及结构式，初步获得松花粉化学成分31 个；通过TCMSP 提取松花粉化学成分8 个。对检索到的化学成分进行合并，最终获取化学成分35 个，见表1。通过SwissTargetPrediction 数据库进行靶点预测及筛选，获取靶点953 个，对重复值进行删除，最终共计获取松花粉靶点300个。

2.2 高脂血症相关靶点的获取

通过检索GeneCards 数据库共得到高脂血症相关靶点4815个，删除重复值后剩余3061个，以相关性得分≥1为原则进行筛选，共得到相关靶点897个；通过检索OMIM 数据库，共得到相关靶点860 个。将两者进行整合并删除重复值，最终得到高脂血症相关靶点1550个。

2.3 PPI网络构建

松花粉成分相关靶点和疾病相关靶点取交集后，得到共同靶点68 个，韦恩图见图1。将共同靶点提交至STRING 数据库构建PPI 网络模型，见图2。将化学成分和交集靶点导入Cytoscape软件绘制药物成分-交集靶点蛋白网络，见图3。节点大小与成分-靶点蛋白网络内节点连接数呈正相关。山柰酚、(2R,3R) -2-(3,5-dihydroxyphenyl) -3,5,7-trihydroxy-2,3-dihydrochromen-4-one、香橙素、β-谷甾醇和花旗松素成分节点的连接数≥20，可能是松花粉潜在关键成分。使用Centiscape 插件计算中介中心性和度值，计算后排序前10 的靶点蛋白见表2；使用MCODE插件对相互作用关系进行分析，得到潜在关键子网络，见图4。子网络内部连线密度较高，外部连线相对较少，因此被认为是潜在具有生物学意义的集合，可能为蛋白质复合体或功能模块，具有更密切的相互作用[24]。

表2 松花粉治疗高脂血症关键靶点

图2 松花粉治疗高脂血症靶点PPI网络

图3 松花粉成分与高脂血症交集靶点蛋白网络

图4 松花粉治疗高脂血症靶点PPI网络中子网络

2.4 富集分析

针对68个关联交集靶点，利用Metascape平台进行GO 富集分析和KEGG 富集分析。GO 富集分析显示，分子功能可能与核受体活性（GO:0004879）、脂质结合（GO:0008289）、氧化酶活性（GO:0016491）、激素结合（GO:0042562）、类固醇激素受体活性（GO:0003707）、磷酸盐结合（GO:0019902）、受体调节（GO:0030545）等相关（图5A）；生物过程可能与类固醇代谢（GO:0008202）、炎症反应（GO:0006954）、活性氧化物代谢（GO:0072593）、细胞脂质应答（GO:0071396）、激素调节（GO:0010817）、代谢物前体和能量生成（GO:0006091）等相关（图5B）；细胞组成可能与受体复合物（GO:0043235）、囊腔（GO:0031983）、核膜膜间隙（GO:0005641）、细胞膜（GO:0098552）、细胞外基质（GO:0031012）、RNA 聚合酶Ⅱ转录调节复合物（GO:0090575）等相关（图5C）。

图5 松花粉治疗高脂血症靶点的GO富集分析

KEGG 富集分析显示，松花粉治疗高脂血症的作用机制可能涉及缺氧诱导因子HIF-1 信号通路（hsa04066）、过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）信号通路（hsa03320）、卵巢类固醇生成（ko04913）、脂肪细胞脂解调节（hsa04923）、胆汁分泌（ko04976）、胰高血糖素信号通路（ko04922）、类固醇生物合成（hsa00100）、脂肪消化和吸收（ko04975）等，见表3。

表3 松花粉治疗高脂血症靶点KEGG富集分析潜在的相关通路

将子网络进行KEGG富集分析，显示子网络1和2 与胰岛素抵抗（hsa04931）、HIF-1 信号通路（hsa04066）、类固醇合成（hsa00100）可能有关，子网络3未见到相关基因≥2的潜在通路，见表4。

表4 松花粉治疗高脂血症靶点子网络KEGG富集分析潜在的相关通路

3 讨论与总结

松花粉是中药中少有的花粉类中药材。近年来，关于松花粉及破壁松花粉等加工产物的药用和保健价值的研究较多，其含有丰富的营养成分和生物活性物质，具有抗衰老、缓解疲劳、降血糖、美容等多种保健和药用功效[25]。松花粉因其“止血除风”之性，多用以外敷，而内服用药时其调脂作用尤为受到关注[26]。含有松花粉的扶正化瘀方有助于抑制体外细胞和小鼠脂肪性肝纤维化进展[27-29]。马尾松花粉水提物能够促进高脂饮食小鼠脂质代谢过程，使小鼠体质量相对减轻、血脂水平有所改善[30]。樊柏林等[31]发现破壁松花粉能够有效预防大鼠脂肪堆积。多项实验及临床研究均提示松花粉具有较好的调脂作用[7-8,32]。

网络药理学对生物网络进行整合分析，可以提示药物与作用靶点间的相互关系，为已知中药的临床疗效和靶点开发提供理论依据[9]。本研究通过对现有文献的总结，整理了松花粉的潜在成分，作为TCMSP 中化合物的补充。其中柚皮素被证实可抑制脂肪生成并降低脂肪细胞中胰岛素敏感性[33]；龙脑可以显著降低高糖高脂大鼠低密度脂蛋白胆固醇、极低密度脂蛋白胆固醇和动脉粥样硬化指数[34]。

成分-靶点网络体现了松花粉内成分存在复杂的高脂血症治疗交互作用。其潜在关键成分中，山柰酚是一种黄酮类化合物，具有广泛的药理作用[35]。山柰酚可以通过刺激巨噬细胞中2 种高密度脂蛋白受体的蛋白表达，增加巨噬细胞胆固醇外排[36]。山柰酚还可以促进巨噬细胞、肝细胞和肠细胞中肝X受体（LXRs）及其靶基因的mRNA水平，诱导肝细胞PPAR 活性，抑制蛋白激酶B（Akt）并诱导肝细胞自噬，从而降低血浆和肝脏三酰甘油水平[37]。香橙素也是一种黄酮类化合物，具有很好的抗炎、抗氧化、抗增殖活性，可以改善葡萄糖摄取和胰岛素抵抗，并抑制心脏纤维化及相关的纤维生成基因，对心功能有改善作用，这些都与高脂血症的治疗和预后相关[38]。花旗松素同样具有抗炎、保护心血管等作用，可以降低大鼠血清和肝脏的脂浓度、肝脏总胆固醇水平[39]，抑制人低密度脂蛋白氧化[40]。β-谷甾醇对高胆固醇类高脂血症作用效果良好，可以防止或逆转肝脏和主动脉中脂质和胆固醇浓度的增加[41-42]。

PPI 网络显示，在“highest confidence”为最小相互作用阈值下，共存在68 个节点和113 条连接，其中中介中心性排序前10 的关键节点中与调脂可能相关的有类视黄醇X 受体α（RXRA）、β-淀粉样蛋白前体蛋白（APP）、Akt1、磷脂酰肌醇3-激酶调节亚基α（PIK3R1）、甲状腺素运载蛋白（TTR）、过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARA）等。RXRA与脂质代谢和脂肪细胞分化的调节相关[43]，参与胆汁酸和胆汁盐的运输、胆固醇代谢等血脂调节途径；APP 可能参与胰岛素受体结合和胆固醇代谢；Akt1是许多通路的关节靶点，功能涉及细胞生存、新陈代谢等[44]，和PIK3R1 一同参与胰岛素对血糖、血脂的调节[45-47]；TTR则通过参与甲状腺素调节对脂质代谢产生影响；PRARA 是脂质传感器和脂质代谢调节器，其激活可以减少肝细胞内脂质积累[48]，已被证明可治疗血脂异常[49]。另外，与凝血和炎症相关的潜在关键靶点，如血管内皮生长因子（VEGFA）和肿瘤坏死因子（TNF）等，对高脂血症造成的心血管病变有调节作用，可能是松花粉治疗高脂血症的非降脂相关的作用靶点。

GO富集展示了松花粉干预高脂血症的蛋白在细胞内的存在位点和潜在分子、生物学过程。KEGG信号通路富集分析表示，松花粉调脂的作用机制可能涉及HIF-1 信号通路、PPAR 信号通路、卵巢类固醇生成、脂肪细胞脂解调节、胆汁分泌、胰高血糖素信号通路、类固醇生物合成、脂肪消化和吸收等。其中HIF-1 是响应缺氧和激活基因的关键转录调节器，有研究显示，HIF-1信号通路参与氧化低密度脂蛋白的抑制和高脂血症的调控[50]，并且可通过抑制长链酰基辅酶A 脱氢酶与中链酰基辅酶A 脱氢酶抑制脂肪酸的分解代谢[51]。PPAR 在棕色脂肪的形成和体温控制中起着核心的作用，可通过调节合成代谢和氧化过程之间的平衡来调节脂肪组织的动态平衡，存在增加脂肪酸氧化、脂质分解代谢的能力[52]。胰高血糖素则可以降低三酰甘油的吸收和分泌、增加胆汁中胆固醇排泄，该通路可以通过调节肝脂代谢，从而调治血脂异常[53]。

研究结果初步说明了松花粉治疗高脂血症可能的作用机制，体现了松花粉多靶点、多通路、联合调控、调节平衡的特点。但因为在分析中混入较多与高脂血症关联性不明显的功能机制和通路，且针对基因相关作用特点缺乏明确的实验确认，需要进一步实验研究以明确松花粉治疗高脂血症的作用机制、松花粉对比其他降脂药物作用的异同，从而为高脂血症的治疗提供更多思路和选择。