HPLC法测定小儿肺咳颗粒中橙皮苷含量的不确定度评估

王宇 张玉玲 邹丹

摘要：目的： 评定 HPLC 法测定小儿肺咳颗粒中橙皮苷含量的不确定度。方法： 建立 HPLC 法测定含量的数学模型，分析测量不确定度的来源并对各分量进行量化分析和评估，合成标准测量不确定度，给出扩展测量不确定度报告。结果： 小儿肺咳颗粒中橙皮苷含量的不确定度为0.02mg，测量结果表示为（ 1.26 ±0.02） mg，（k = 2）。结论： 分析产生不确定度的主要来源，可为有效地控制该含量测定方法的准确性提供可靠的理论依据。

关键词：高效液相色谱法;小儿肺咳颗粒;橙皮苷;不确定度

【中图分类号】 R722.13+5 【文献标识码】 A      【文章编号】2107-2306（2022）12--02

1 实验部分

1.1仪器与试药

Agilent 1100 型 HPLC 仪; MSA6.6S-CE型电子天平（赛多利斯 d=0.001mg）;ME204/02型电子天平（梅特勒 d=0.1mg）;

小儿肺咳颗粒（吉林省某药厂，批号：20210121）

橙皮苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110721-202019，含量95.3% ）;甲醇（色谱纯，美国Fisher公司），其余试剂为分析纯，水为超纯水。

1.2  实验方法

（ 1） 色谱条件与系统适用性试验。色谱柱：岛津 Wondaisil C18（ 250 mm × 4.6 mm，5μm）;流动相： 甲醇-5%醋酸溶液（33：67）;流速： 0.8 ml/min; 检测波长： 283nm; 柱温： 35℃;进样量： 5μl。理论板数按橙皮苷峰计算应不低于3000。

（ 2） 测定法。取小儿肺咳颗粒10袋，研细，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，超声处理（功率80W，频率250kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。另取取橙皮苷对照品适量，精密称定，加75%甲醇制成每1ml含30μg的溶液，作为对照品溶液。精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，按外标法计算小儿肺咳颗粒中橙皮苷的含量。

2 测量不确定度的分析

2.1 测量不确定度的构成及相对合成标准不确定度的数学表达式

根据 HPLC 外标法以峰面积计算含量的基本原理，小儿肺咳颗粒中橙皮苷含量的数学表达式为：

式中：P为供试品中橙皮苷的含量（mg/g）;Wx为供试品的质量（g）; P纯为对照品的纯度（%）;Ws为对照品的质量（mg）;Ax为供试品中橙皮苷峰面积;

As为对照品中橙皮苷峰面积;Vx稀为供试品的稀释倍数;Vs稀为对照品的稀释倍数;Vx进为供试品溶液的进样体积（μl）;Vs进为对照品溶液的进样体积（μl）。

2.2 识别测量不确定度来源

2.3 测量不确定分量的量化分析

2.3.1  HPLC进样重复性的相对不确定度urel（Frep）

属于A类不确定度。为获得可靠性较高的标准偏差，本次测定了10份样品中橙皮苷的含量，结果见表1。

单次测量的重复性标准偏差按照贝塞尔公式计算：s（x）=1.77%，本次HPLC进样重复性的相对标准不确定度

2.3.2  对照品溶液浓度相对标准不确定度urel（C对）

2.3.2.1  对照品纯度的相对标准不确定urel（P对）

属于B类不确定。按橙皮苷对照品的说明书标示，纯度为95.3%，对照品说明书未给出不确定度，假定其分布区间为±0.05%，按矩形分布换算，对照品纯度的相对标准不确定度为：urel（p纯）=α/k/95.3%=0.05%//95.3%=3.03×10-4。

2.3.2.2  对照品称量的相对不确定urel（Ws）

（1）天平示数引入的不确定度u1（W对）

天平检定证书给出天平（ d = 0.001 mg）的最大允许误差为±0.002mg，按矩形分布计算，u1（W对）=α/k=0.002/=1.15×10-3mg。

（2）天平重复性引入的不确定度u2（W对）

天平检定证书给出天平（ d = 0.001 mg）重复性误差为0.002mg，按矩形分布计算，u2（W对）=α/k=0.002/=1.15×10-3mg。因试验时采用减重法，

称取对照品的质量分别为W对1=6.658mg，W对2=6.684mg，对照品称样量的相对标准不确定度分别为：u（W对1）=u（W对）/W=2.30×10-3/6.658=3.45×10-4，

u（W对2）=u（W对）/W=2.30×10-3/6.684=3.44×10-4，故对照品称量的相对标准不确定度为：

2.3.2.3 对照品稀释引入的相对标准不确定度urel（V对）

校准引入的不确定度u1（V对200）

200mlA级容量瓶的最大允许误差为±0.15ml，按矩形分布计算，则：u1（V对200）=α/k=0.15/=8.66×10-2ml。

温度引入的不确定度u2（V对200）

定容在21℃下进行，量瓶校正温度T0=20℃，水的体积膨胀系数为2.1×10-4/℃。按矩形分布计算，u2（V200）=α/K=200×2.1×10-4×（21-20）ml/=2.42×10-2ml。由以上2项合成得相对标准不确度

urel（VS）= /200=4.50×10-4 ml

2.3.3 供试品溶液浓度的相对标准不确定度urel（C样）

2.3.3.1  供试品称量的相对标准不确定度urel（W样）

（1）天平示数引入的不确定度u1（W样）

天平检定证书给出天平（ d = 0.1 mg）的最大允许误差为±0.5mg，按矩形分布计算，u1（W样）=α/k=0.5/=0.289mg。

（2）天平称量重复性不确定度

天平检定证书给出天平（ d = 0.1 mg） 的重复性误差为1mg，按矩形分布计算，u1（W样）=α/k=1/=0.577mg。因称量过程中使用减量法，故其不确定度为。称取10份样品的平均值为3.0584g，其相对标准不确定度为urel（W样）=u（W样）/W样=0.913/3.0584×10-3=2.99×10-4。2.3.3.2 供试品溶液稀释引入的相对标准不确定度urel（V样）

（1）校准引入的不确定度u1（V样50）

50mlA级移液管的最大允许误差为±0.05ml，按矩形分布计算，则：u1（V样50）=α/k=0.05/=2.89×10-2ml。

（2）温度引入的不确定度u2（V样50）

定容在21℃下进行，移液管校正温度T0=20℃，水的体积膨胀系数为2.1×10-4/℃。按矩形分布计算u2（V50）=α/K=50×2.1×10-4×（21-20）ml/=6.06×10-3ml。由以上2項合成得相对标准不确度

urel（V样）=/50=5.90×10-4 。

2.4 计算合成相对不确定

可知合成标准不确定度是：

2.5 扩展不确定度  测量结果符合正态分布，取置信概率为 95%，包含因子

2.6 测量不确定度报告

3 讨论

本文通过对 HPLC 法测定小儿肺咳颗粒中橙皮苷含量的测量不确定度评定，分析了各测量不确定度分量。由分析结果可知，最大的测量不确定度来源于对照品的称取量，提示今后进行小儿肺咳颗粒含量测定试验时，可增加对照品的取样量，降低对照品称量时引入的不确定度，增加测定结果的准确性。本文所建立的评估方法可为同类型的药物含量的不确定度分析提供参考。

参考文献：

1 国家质量监督检验检疫总局.测量不确定度的评定与表示[S]：JJF1059.1-2012

2 中国药典[S].2020 年版.一部.563

3 左毅，费路华.HPLC 法测定甲硝唑片含量的测量不确定度评定[J].中国药师，2015，18（ 09）： 1612-1614

通讯作者：刘汇  副主任药师   延边州食品药品检验所