棒曲霉素对KM小鼠肾脏的毒性效应

张百刚，徐冬梅，邵琳，鹿琪坤，梁海荣，李金亮，黄橙辉

（兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730050）

棒曲霉素（Patulin，PAT）是青霉属菌和曲霉属菌等产生的一种有毒次级代谢产物。目前，对于PAT的毒理学研究主要集中于其对肝肠胃的毒性及皮肤毒性，对肾脏的毒理作用研究较少。在各种食品中均可 发生棒曲霉素污染，其中苹果是最为常见的被污染水果。因此，将苹果、苹果汁和其相关食品中棒曲霉素的浓度用作质量指标[1]，我国国家标准也对食品中棒曲霉素含量作了详细的规定[2]。人们接触棒曲霉素主要是通过食用被污染的食品，而食品在不同的阶段如种植过程、收获期间、收获后、运输期间、储存期间、陈列期间和整个加工阶段都有可能被污染[3,4]。在食品加工过程中卫生条件较差的地区，由棒曲霉素产生的风险会更大[5]。高浓度的棒曲霉素对不同种族、性别和年龄的人群都会产生影响，其中婴幼儿、孕妇及胎儿等都是敏感人群[6]。

有研究表明，PAT可引起急性和慢性中毒，PAT给药的实验动物外部表现为焦虑、抽搐和呼吸短促等，内部表现为肺部充血、溃烂、水肿、血液外渗和胃肠道疾病等，并且PAT还具有细胞毒性和遗传毒性[7,8]，这可能与半缩醛和内酯环的毒性有关[9]。虽然目前国内外对棒曲霉素的研究较为广泛，但对于肾脏的研究仍然不够充分，而肾脏作为人体重要的解毒器官，对PAT的代谢起着至关重要的作用。因此，本研究以KM小鼠作为实验动物，取小鼠肾脏最大横截面做石蜡切片，然后制作HE染色，Masson染色和过碘酸雪夫染色（Periodic Acid-Schiff stain，PAS）切片，结合体重增长率及脏器系数等，从外观形态，生理生化方面评估PAT对小鼠的毒性效应，尤其是对肾脏的毒性，探讨可能的毒性机制，为进一步探究其毒性效应提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

棒曲霉毒素标准品（纯度≥98%），上海哈灵生物科技有限公司；HE染液、Masson染液套装、PAS染液套装、苏木素染液、分化液、返蓝液，Servicebio；中性树胶，国药集团化学试剂有限公司。

江南永新MR2100倒置显微镜，上海向帆仪器有限公司；WHB-7105-1普通载玻片25×75 mm，祺翔生物科技有限公司；美国RAININ Pipet -Lite PL+单道可调移液器，Mettler Toledo国际贸易有限公司；ES-J分析天平，德安特传感技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 实验动物饲养和PAT预处理

KM小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，均为6周龄左右。饲养环境整洁安静，通风良好，温度、湿度适宜。72只KM小鼠雌雄各半并且被随机分为6组，其中一组为空白组，空白组以无菌水灌胃，其余五组分别以2.5、5、7.5、10和15 μmol/L PAT灌胃，灌胃标准为0.1 mL/10 g。每天灌胃前禁食6 h左右并称取体重，连续灌胃28 d后处死取双肾，称量肾脏重量，然后进行后续试验。

式中：

初始体重——灌胃前禁食6 h后体重，g；

当次体重——不同浓度PAT灌胃一定时间后体重，g；

双肾重量——不同浓度PAT灌胃28 d后双肾湿重，g；

体重——不同浓度PAT灌胃28 d后小鼠体重，g。

1.2.2 石蜡切片制作

新鲜组织用固定液固定24 h以上。固定后的组织水洗后依次用50%、70%、85%、95%及无水乙醇进行脱水，脱水后从无水乙醇中取出组织块先放入二甲苯和无水酒精等量混合的溶液中1 h左右，然后取出放入纯二甲苯中20 min即可。然后进行浸蜡、包埋、塑形。之后的工作由武汉塞维尔生物有限公司完成。

1.2.3 HE染色

染色前依次将切片放入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各20 min脱去切片中的石蜡，再依次放入无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、75%酒精中各5 min，最后入蒸馏水后即可染色。水洗后切片入苏木素染液染5 min后，蒸馏水洗去多余染液。显微镜控制下用分化液分化，镜下观察细胞核蓝色、组织背景几乎无色时，自来水洗终止分化。水洗蓝化15 min后，依次放入85%、95%的梯度酒精脱水各5 min。浸入伊红染液中染色5 min后，依次放入无水乙醇I、无水乙醇II、无水乙醇Ⅲ中各5 min进行脱水，再依次放入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各5 min使切片透明。将已透明的切片用中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集分析。

1.2.4 Masson染色

石蜡切片脱蜡至水，如1.2.3所示。切片入重铬酸钾浸泡过夜后，依次自来水和蒸馏水洗。切片入Weigert氏铁苏木素染液3 min后，自来水充分水洗，1%盐酸酒精分化液分化数秒，自来水冲洗，流水冲洗数分钟后返蓝液返蓝。用丽春红酸性品红染10 min后，蒸馏水快速漂洗。1%磷钼酸水溶液浸染1～3 min后，不经水洗，直接用苯胺蓝染液复染5 min。1%冰醋酸处理1 min。将切片依次放入95%酒精I、95%酒精II各5 min，无水乙醇I、无水乙醇II各5 min进行脱水。再依次放入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各5 min使切片透明，中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集分析。

1.2.5 PAS染色

石蜡切片脱蜡至水，如1.2.3所示。切片入1%高碘酸染液中染色15 min（溶液温度以17～20 ℃为宜），流水冲洗5 min，再用蒸馏水浸洗两遍。Schiff氏液（Schiff氏液从冰箱取出升至室温使用）避光染色30 min，流水冲洗5 min。Harris苏木精染5 min，自来水洗；l%盐酸酒精分化液分化，再用自来水充分冲洗。返蓝液返蓝，流水冲洗。脱水封片方法同HE染色。显微镜镜检，图像采集分析。

1.2.6 数据分析

记录灌胃前小鼠体重，连续灌胃28 d后处死取双肾，记录肾脏重量。计算体重增长率与肾脏系数，取平均值，结果以“平均值±标准差”来表示。采用SPSS 26.0对实验数据进行统计学分析，6组数据间采用“One-way ANOVA”的Duncan’s法进行比较分析，p＜0.05为差异显著，标记为“*”。

2 结果与讨论

2.1 PAT浓度对KM小鼠的体重增长的影响

连续28 d对KM小鼠灌胃给予不同浓度PAT，每天禁食6 h后称取体重，每7 d对体重取一次平均值，体重增长与PAT浓度之间的关系如图1所示。不同浓度的PAT对体重增长率的影响有高有低，与无菌水灌胃对照组相比，各PAT剂量组受试小鼠体重增长率与对照组无显著差异（p＞0.05），不同PAT剂量组之间的大鼠体重增长率也无显著性差异。除在14～28 d之间5 μmol/L PAT影响稍大外几乎无规律。由此可判断连续28 d给予KM小鼠15 μmol/L及以下剂量的PAT对体重增长率基本无显著性影响，两者之间几乎无相关关系。

2.2 PAT浓度对KM小鼠肾脏系数的影响

连续28 d对KM小鼠灌胃给予不同浓度PAT，试验结束处死动物，记录双肾湿重，计算肾脏系数，各组动物肾脏系数统计结果见图2。随着PAT浓度增大，肾脏系数亦有逐渐增大的趋势，与对照组相比，PAT组中7.5 μmol/L和10 μmol/L PAT处理的差异显著（p＜0.05）。虽然PAT组之间差距并不大，但相较于空白组，PAT组整体都大于空白组。肾脏系数增大即说明在体重无明显变化的情况下出现的双肾增大现象，而双肾增大常见于肾积水或者肾脏部位炎症，如急性肾衰竭、急性肾炎、双侧急性肾盂肾炎、双侧肾盂积水等多种肾脏疾病。因此，可推断PAT为7.5 μmol/L和10 μmol/L时即对肾脏造成严重损伤；而当PAT为15 μmol/L时，肾脏细胞开始皱缩凋亡，因此，肾脏系数下降。

2.3 肾脏切片HE染色

取肾脏最大横截面制作HE染色切片，观察肾脏细胞的基本外观。对照组细胞核核膜界限清晰，染色无异常情况。当PAT浓度为2.5 μmol/L时，细胞核略微减少；PAT浓度增为5.0 μmol/L和7.5 μmol/L时，可观察到大片细胞基质和胞外基质，蓝紫色细胞核逐渐减少且细胞核密度逐渐降低；PAT浓度为10 μmol/L时，视野内可见大量条状空白，细胞核明显减少，颜色模糊不可分辨；PAT浓度为15 μmol/L时，条状空白增长变为长条状，细胞核颜色减淡并多聚集于长条状空白两侧[10,11]。染色结果说明随着PAT浓度升高，肾脏细胞逐渐皱缩凋亡。研究表明，肾脏有核细胞数与凋亡指数之间存在负相关，而凋亡细胞数又与肾功能恶化成密切正相关。

2.4 肾脏切片Masson染色

取肾脏最大横截面制作Masson染色切片，观察肾脏细胞的基本外观。Masson染色结果为胶原纤维呈蓝色，肌纤维、纤维素和红细胞呈红色。如图4所示，对照组细胞间界限清晰，肾小球无明显硬化。PAT浓度逐渐增加时，可观察到蓝色胶原纤维逐渐增加，细胞间界限逐渐模糊。结果显示PAT使肾小球发生明显的纤维硬化情况，且胞间充血，说明有炎症出现，初步考虑为肾脏纤维化的炎症反应期，如果延长PAT给药时间很有可能形成瘢痕，对肾脏造成不可逆的损伤。

2.5 肾脏切片PAS染色

PAS染色的目的是为了观察细胞的糖原降解情况，糖原在体内酶促作用下的合成和分解可维持血糖正常水平。在动物体内糖原大部分存在于骨骼肌中，肾脏中液存在少量糖原，由图5观察得知，对照组几乎无大面积糖原，说明糖原被大量降解来维持体内的基本活动，当PAT浓度为2.5 μmol/L时，糖原增加，染色明显变浅；PAT浓度增为5.0 μmol/L和7.5 μmol/L时，可观察到细胞中出现大量糖原，细胞皱缩，细胞间隙增加；并且随PAT浓度增加，糖原累积逐渐增多，细胞间隙增大。肾脏作为糖类储藏和释放的场所，人体内多余的糖分在这里形成肾糖原加以储藏，需要的时候又能转变为葡萄糖来补充血糖，血糖升高时只要肾脏功能正常，就可以通过排尿将多余的糖分排出，使血糖不至于太高。而当PAT浓度升高使肾小球受到损害时，肾小球滤过率降低，这不仅会对细胞和机体的ATP生成产生影响，糖原的累积势必会影响肾脏结构和功能，引起各种并发症。

3 结论

本试验设计不同浓度梯度PAT，28 d连续灌胃KM小鼠，并按照正常条件饲养，以此评估试验动物在不同浓度PAT下造成的肾损伤作用。经过不同浓度处理KM小鼠后的灌胃实验结果表明体重变化与PAT浓度几乎无关联。随PAT浓度增加，HE染色后可观察到大片细胞基质和胞外基质，肾脏切片中细胞核明显减少，核膜界限模糊；Masson染色后肾小球切片可观察到蓝色胶原纤维增多，且胞间充血；当PAT为7.5 μmol/L和10 μmol/L时，PAT组肾脏系数皆高于对照组，差异显著（p＜0.05）；而当PAT为15 μmol/L时，肾脏系数相较于PAT为10 μmol/L时发生了下降，由此可推测PAT浓度在10 μmol/L及以下时，肾脏虽然有自修复能力，但仍然有肾积水或炎症存在，随着PAT浓度增加，肾脏细胞皱缩、凋亡指数增加，肾功能损伤，逐渐有肾脏纤维化的倾向。因此导致肾小球滤过率下降，故PAS染色观察到大量糖原沉积，可知糖原没有被正常代谢，这不仅会对细胞和机体的ATP生成产生影响，还会使肾脏进一步损伤。